"7° Congresso nazionale delle Biotecnologie" - organizzato dall'Università degli Studi di Catania, in collaborazione con Consorzio Interuniversitario delle Biotecnologie (CIB) e con il patrocinio della Regione siciliana, della Provincia regionale di Catania, del Comune di Catania e del Parco scientifico e tecnologico della Sicilia, del Consiglio nazionale delle ricerche (CNR) e dell'Accademia Gioenia (presso l'Aula Magna della Facoltà di Agraria - polo bioscientifico, Via Santa Sofia, 8 - 9 - 10 settembre 2004)

Ogni giorno a due aumento qualche vivo centri terrestre
Pareva esserci una osti nome patacca oggi
Muore a fuel spiccano i stessi buoni dice Walter immerse
Visto il riemergere Stefanel spicca a spettassero giusto va
A poveri e anche io ho visti che io pagavo saremo desumiamo vuoi perché capisse stipare ve ne paghi una decina cifre spiace
Tensione le minacce professor battersi
Canta in gioventù
Pentium professore doveva soffrì
Anche accertò anzi
Che
Se della caccia allora dire non vai professor Battaglia Butterfield Rina studenti
Disse Örgryte circa forni piccolo s'ipse
In tre D Urso background Obama ad
Tony che ai cui spicca il balzo dentro
And estinta o di you yesterday
Di Camillo repertare d'
Unici sbilenca su play incrociarlo invocata Genesis commossa studi SIS essercene reti d'
Sud proteolitica processing Odyssey produttori
Nenad e il PPI questa scelta
Steso
E Peter retta Precursor prodotti
Qui
A Interest intestati o norma Hoffman Scianna o distrutte
Tex of course is notturna Prius e Toxic Perca
Parte da
Issing troppo lì è Barry importante fasce Ind. Nervo system
Bindi dispero degne
Veneto serve ad
Su è un ruscello
De
Sorge
Processing ovvero Etp vai Big Band gamma segretezza disse
Le salse indigene riesce o
Vita mi dovete portare batto corso Ind. Generation o e svolto ettari including most old sacro soli o meno otto epicrisi
Quel che c'è
Il signor Willis Reed fronte mentre un a Paolo per chi legge by gamma segretezza
Dispetti tali tutti i big considered by prima d'accatto hold
Processing per il PPI Emmett
Tu generi soldo forno Aldiss Monicelli batteristi soldi sperimenta l'evidenza tengono stretti detta di spetta essere Hicks Home
Francia anzi
Da sabato e domenica ove il PPI quei celebre Sands
Mentre parto Obama ai del
Contenti se e
E Monti & Pitti guai qui ci si presenti in Menni
Membri prepotenza
& visse Mortis intera sicuri più di e fissi si fa il prudente e indosso guida del più intense accesso ex Lenna
Nambu città Enzo
Perciò sono invece hanno conquistare lo sente
All'Aussa
E bottaio sinché Ennis and
Chic adatto sono trenta tenterà with disse
Sai sul documento
E si pensi disse ma lei Gramsci Maryse regard & Complex sentire Aldiss
System
Isso
Even more è evidente effluvi consigliere detto
Terranno
Tumore ginseng Coding prepotenza nelle simile al Tour il PPI Nembo Kid e Pier più ammende Pierre pitture
And
Siamo ministro penso
è un
A prodotte saccente surfisti farla quando hai più exile vita ex Lehman gamma pelli similari
è Otis prudenza appena disturbi veri conservato il di un rinvio Evolution
Perché insiste fare esterna caratteristiche sa ove inadatto il proprio tempo
Il possesso quando ad Abu Dhabi went to Pitti Bydo mense & Car PACS termine al Pitti bivio Menin Carax Wind PPP Orbit e che è il più ammende più il pittore
District prepotenza al presente in Nord Mohammad Ghannouchi Novus fare in concreto Vajont ma male Hanging Gino Onlus Hexham nel suo fare
& Harris guadagna prodotte in vedi simile tuffi Sisti fare osso and
In duo orma Insiel Leganza & guide mosse Beretta
Distrutto in terrazzo Wind
Porto l'orgoglio PPP tra poco si eleganza
Quando quindi no Servette fissi si fa in terrazzo mi dei Pitti qui io reti niente prefissi si fa i sepoltura ActiveX trascritte Jean
And
Eh sì o che anzi indisse suadente
Io me ne L'Espresso ove fissi Stifani ricombinante fissi si fa così salsa Ind.
Localizza esso Nordest ottenne indiano Prius
Thesis
Insisti faida il soggetto Geppi & e silenzi e Kiss
Mostri prese in del nucleo suite di ex clochard ovvero nucleo alla RAI
Batto e fui
Ove l'Express ex segretario nel senso fissi Stifani vendi Pippi
E signor benzine fissi si fa scrisse excludendum frode non plus
TAS mi cheating detta e Pippi Function s'essa è un ex hanno Pierantonio preventivo del nucleare traslochi Jean nove fissi Stefani
Disse and aveva
Sas supporto di epoche Siss deve del
Proteolitica processing ove e il PPI CUD Bailey del meccanismo
Detta vecchio Lezzi
Del nucleare localizza diciannove fissi strisciare
Infatti a Ponte
Clivet genovese PPI by gamma se cretesi da compila X
Including fissi Stefanel and
Ehi della
Poi e Pittin trasferire gradualmente Isserlis insomma da membri N and is
Deve tutt'd'
Diffonde Destination
E nato in URSS d'nonché ex
Della Menni
Peters
Supporti vietano Thesis detto
E il PPE fissi Stifani Complex could have been Loved Indre io Nation ginestre Jean patti dell'Arsenal no limits dette
Alimento via dress
Esco a Wrexham pollo da meccanismi s'su ICI e PPI & fissi si fa Hewlett sovrascritti Jean
Jeans cardine ovvio dis
Lei violation
And d'possible conseguenze secondo disse
Tre io lei Jean
Gwen da
Quando
Però se si otto
E Lippi Pisa a ottenere e ti senti dentro detta
D'miss Francia quindi Aldiss machinery
L'esausto indigene vision ovvero e i Bica o Anna fortitudo età ed Pettis Doohan Witch
Aggreghi Izz Moreno is lì Denna
Quando forti
Le salsine mi Heenan in Kristel Production ovunque e in vita batto corso in e miss Reggae National disfa nome non could mean ed altri Shammah ovunque Jim ex verso
Petto Samburu Ind. patto Genesis poco
Alzano ex Mrs
A
Quando un poi mentre lui ha
Ad essi is d'Molay gran machinery Inuit esce e il PPI n fissi si fa entrare in volto
&
Qui orrendi no dette fissi si fa Interfax Wind e Mick Easton assetti trasferisse Nam detti Syxty
Ente o Wind Aid & di gruppo Jeff Rosen Ferrod
Alla hold
University of California in San Diego temo sede disco ex IST in Craxi Wind
Di Annie
Su cromatismi mono presidente Jean Experiment s'
Qui
Tema nostre sette fissi si fare l'intera cassa Wind LSU
Batte in bocche Isis LSU orti psicosi hanno Responsible fuor di Activision del Transit Jean medi dai e fissi strisciare
Solo
Qui design tu addestra disponente nato Awards tu
Abbastanza da meccanismi s'and da prontezza in nuove in disfi normalmente
Tutto disse lui russo ed è un approccio o un Houston Méniere seggo in
Memi la Barberis
Bottom line disse tutto sui generis Bess and onde possibili di tutti i sette
Kiss trascritto c'è un fatto
Diamo fuoco inaugurarla ex sei
Invece ti sposti proprio tu hai soletta detiene i bagni emendamenti enti attivi scendono mentre detiene bagno Domaine inter Axa Midi Emery batte artista hanno evoluto attive ha scritto Jean
Battiti si posseggono tutte le band è un'attività scricciolo Factor by genere degne fusion per ottenne invece detiene venendo meno Gaffo rischiose due proteine e i contratti vede trascritto Charmaine desiste Creso prefissi Stifani
Sono lieto generated memi
Cioè c'è un prodotto Enzo
In cui s'differente Parts ovvero e fissi Stifani varius d'tutte abbiamo forti e mi bende o meno
Un'intesa Salucci lui nave
Regge Anna Biffi Sisti fare per Able to activité subscription
E cioè includesse viabilità più duramente
Battere del davvero dato le Domaine è l'ormai esame voluto attivi trascritti Jean
E si pensi decorso Servant Iss in Active
Solo at least Twenty
A resti di ossa at
Accardo a Xì Terminus Old da Polito più Domaine r'n'SSI lì tu ottenne
Guttuso Ranza Activision
And
Dal far East con Servet cripto Fendi Residence Old da bio dal più Domaine Candy di libertà di Little guidata Fetting de trascritti cento solo
Del regional un Responsible forti arti Vesce hanno avuto trascritto Cermis no sulla i doppi Domaine Vattimo
E legge Hannover qua quindi lui abita più duramente Queen M. decorre Ricci States Ford a Predappio overlap quindi Ricciardi
E insiste si pensò ad precari
U.I.C. Conte INPS dei information SSN forti Activision altra scricciolo o delle porte Cineland virus ed è uguale lì virus d'approccio tu hai sorretta
Possibile on line Guns ovvio disse Money chiusi
E teste sempre alla fine di cromatografia Inuit del per Taide is user desse Bates tu hai son le hit proteins Interactive Guidi
Però se generis di vestito Honda
Da da Cell extra is Frost cioè cleared ognuna e colon ex sposi in via
E per Skid
Bene disse mio Trichet non s'qui ci ripensa
E fissi si fai tu Active Izzo trascritte Jean
Del futuro Discovery Was acqua ed Hondt Colombo contenga d'While trae trattare sì Lanza e di e lunedì o disco Was
Al sei pareggi di Bari estive specie
And the bands io no
A ex Cissé Stronghold Gelli
& dai gesti verbali sempre & quid d'
Cruciale OPA Andrea Scaloni lui è determinante ITC proprio viene ai denti fare impicci proteine by Massa Spectrometer
Ed in particolare dissi band vostre mostre tutto di e proteine name and sette
Quei cibi lo ha lo studio family poco
No Pilo somma assemblee produttori dispero utenza terza Camera uno differenza Function sì including Jen regulation
Formata da vai con il mondo visibile sciame Experiment With the nostre Letter
De Complex
Contegno affissi Stifani avendo sex il bimbo is
Indi depresse infrarossi
Sono quei Actress
Questione
Owen
Sette East prodotte in Responsible forti Activision hanno trascritto scialba e fissi fare
True
E
Tutti e sei e critica l'approccio
Considera indi detto qui speck detta settore L'Espresso
In ius ENI in crisi
Trascritto Shammah Pound reporter GM Quayle sette statue Jean
Cose is e di crisi o di Espresso o delle porte del PCI
Di fronte sette is
Del prodotto in in volta ed indiscriminata non
De Feo sta a processi veri Simple
E si pensi by overheads pressing predominante sette
Qui Observer detto
Trascritte Jean onde Cartagine is in crisi
Hyder Bayou Singh d'pianoforte fissi si fine full-length costrutto ormai using vediamo for eh sì sì Stefanel fu c'è un prudente con training da minimal regge il nome fissi Stifani messe se ritratti inediti trascritti certo
Disse fenomeno Amneris specifica considera in vetta
Per l'ex Brescia o no
Sette
Eh eh se no effetto onde trascritti Jean ho avuto ricatti GM in Saras ex pressing
Caos Foro OLO prodotte
La
De Sutter lasciano offrendo al giorno sette agosto Tenet by venne Inter Firenze Ezio noto disse
Passeggero
Was
Prese tondi tondi Observation originali mette immersi eleganza dette Dabo assente Dorigo nucleo Tabarez allora Able to target
Specifiche Messenger nei compiutamente rimesse svolge Nese in service
Indi using Degradi Jean ovvio
This mole ius tendenza pressing Splash ho avuto pagine
Doping di Gino ma
Rendersi Nava
Posseggono at least in principal tu sa Press EMI GM in Crozza Sas
Lui Houston tu differente double strand
Allora nei obbligo inutilità Rizzo tanti Thing sette
Prende il signor Renzi
Members Old sette prodotti
Is si identifica Tilli di Cristina in caserma
And
Disse Salus
Ind.
Ridacchia o di ex Fashion onde carteggi
In sesto trasferte dubito
Tiriamo fuori fissi si fa full-length con sotto and causa Fowler fissi strisciare
Fucka introdotto in Wind Mimina l'elemento
Disse Minster
E triste Ford
Reporter Jim approcci sette is necessari
Ford
Activision ha scritto Jean scrivendo a Bari e fissi strisciare
Batte
Lui
Notte
Ti sei evidente Betts demo session ho detto sempre
E si parte otto per completezza riguardarsi mamma in vigore splendens sobri toccato i vantaggi insomma di Observation Iron lady mensilmente
Dette e fissi si fa Forbes e Complex
Onde Cairo ANCIM promoter
Discutibili ai solette Dubai cromati nemmeno al presidente Jacques
Suvvia tra S due sette
Peace pressante indisse Complex
N si pensi coinvolge Citation ex cromati e non in manovre segrete Jean Experiment s'collauda astute mosse tetti in sella strass fette Twitter fissi si fa il sette dei PP
E mia madre si ripete d'
Trovati nel contempo se
E quando un Gin promoter Riggio hanno detto IST ampi faide indisse Experiment sic
& di antenne cordis
E Bolt su in mano al presidente
Cromati nel contegno di sconto ex a anche fissi si fa batto corso anti sette and anche il PPI su disse bensì de de Complex continenza Aldiss prudenza
Da Obodo cromati memorabile si vede Jean Esperey Renzo
Metto in cui distante edodes parlava il tasto dei nostri dette
In the Complex
Al contempo la ripresa spetta senta impresa e fissi si fa è fallimento dei PP Guidi
Bellini de di ITIS e
Tech Syxty & & sette
Ho scorso Eastman Vettel lui che annaspa vecchi
Net modify
Di amount of sette in essendo trascritti Scianna Aldiss GM
C'è il derby
Modificare
M This is the cat is
E Kenneth by e venne interferenza cui s'appresta di ex Fashion ottantasette
Prepotente
And
Mai real tanti sia lui Demostene detto dal members ove decade quando Messenger anni is perde dall'emersa al di Cristina significante lì a Ponte Sant'fashion ovvero
Gli ex lasciano sette prodotte
So di Squinzi Bette Queen a o R
è un ex sperimenta assiste in lui esce
Tutta esterna
E arredi tu hai tu hai venti fare DRI oggi Enzo Review Letters tre by
E fissi Stifani and e il PPI
Erano
Di sistema las Wahid ai
And insiste risalto era Experiment qui da and Onno which we are un working
For
Memi Monks
Va oltre e miele
And e che s'Nozza informati disse Sly batte
E
It show si chiude federale me i jeans
E Tarreg lettere d'in Serres Inuit di Effy si si fa e Pippi sette Comprex is Lecce indiano flusso
And
We are testing
M. valide meeting
X Aldiss jeans
Tu
Da di di Einaudi suo Orchis
Two one stende
Vuoto a pranzo immerse nel e lui disse machinery
E si notte corre chili franchising
A quanto tu hanno gli occhi
People Warduni Ingrid i suoi
Membri Francescato investe and Davide Gianni uguali
Turche ciclistico dentro e mai laboratori and Jeff Rosenfeld
Lui cerca Daf insegue erano queste and Andrea Scaloni & Easy Krupp Ford ma spettrometri od
Per tutti
Fragments con lo spettro tre pensieri marcia
Spetta a otto Furka chance
Somme Riario c'è stata scappi qua nel mio ecco a sto tra e attese Stifani sinistri proprio in può pro fase a sedici squadre
A monte esisteva Terence tra si soccorre qui vero dei incerto in acqua stress test otto invece spenta fisse Steve Vai
E anche il PPI nel braccio by lui lui qual era ancora un po'
Causa invertirsi sporche at espone sezione anche quattro soste
Chi sono Vienna ipotesi essa and
Da da me è imponente qui è un work in Turris lui Al Gore non io resto antistante Function o dispone che il
A guerra e chiama di Exclusive de in è vero lei lì
Stage o dell'Isis
Da mix facilmente ovvero d'machinery Code Comus
E e in altre scene Ind. fisiologico Newton
Sono predispose Serres tutto Toxic effect pompa e vita
Ma I want to solo io penso non
Fatte
Numero s'ovvero degenze cui arriva Working on including sette patto Sonate prudenza all'in volto in ha rotto stesso old ignoranza e andò ho avuto osso ad Saras solo i Scud B e possibile
E che problema c'è io rientrarci in faccia
Osare ai sete così percezione quando
Grazie
A San esplode Francia nove Etp & e ed è otto alla corte stessi XT faide Ind. in gola iniziano a patti se eleganza
Qui ottenne dei no cauto ove si si si fa orto lo in sia Elegance
& fino al tetto is e in altri riesce a non ovvero
Retto faringe al Pantheon
Pizze ignorò la fino a tale and Pittis
Poi d'semifinale tale bene simile al fino al fino a tale ovvero di knock-out ovvie Pieri
One di orto laddove il PPI
Sotto accanto disturbi l'utenza rifarsi sembra fino a tardi and Inter Firenze
Ovvero e fissi si fa Ondine Pipino H otto Old Inter Firenze ovvero e il PPI Ondina fissi si fanno cauti Sas in eh
Moro servire fino fino a tale basta da Sam noir
Ma
Sono This is good for nove mostre esce
Sì sì se fare dei PP Aronde sembra fatture
And è triste indurlo però ogni Function ovvio e il PPI per i quali l'ex Effy si si fa and vai su verso
Ventitré marci o Antoine ex presentation paesi professor Sergio papà Palmiro persino pari io squalifica vanno prospettare per sporgere i campo ex Juan su cui collezionabili nel senso che nel secondo voi bagliore scenderà in genere terroir Scotto Swords
Perché non e potesse battersi Ruth presso la Edwards sente veri Marcello Maria Giuffrida & Mario Magnani ora era invaghito di ferri Naismith secchio
Perciò degli I Am Going truccata Salman spezzò di fisiopatologico Complex Guanda
Specie emersi from Research effort cioè fatale laboratori nei collaboration visse Colli salto di no superstar University
E invece il caglio e Gruppi Emeka NI Nederland Dance Group farei ti cieca capito in frac
Alcove sull'anno di respiratori Channel
Padova Isis di fare sistema opti respiratori Champions decidono venne dieci mai
Pupi quei non dei scomporre SIS di retribuiti piste sportivo overoll Activity io di respiratori cena
Izzo essa cioè mensa e ciò otto fra i dati volgendo verso i nostri OCSE ingentilita liturgico risentito ispiratori cento
Inserite nel sette ispanici sono conclude Xuan un mai staffetta apoptosi is
The Spleen i sentimenti last Emir Fountain
Mio Tenshinhan se in Sabbioni insomma complesso Anna Rimbaud certi ne ereditaria encefalo Maio cardio Patisso
Per inserire aspetto se disprezzo compra Xuan ah Rimbotti Insam sforzo Parkinson Disease
So from pochi siti Scalia detti se topico oppure Whitey interesse indie
Se il tono esistenti sono balene accedi Xanthi paio Chemistry
Conclude Suma Nietzsche dir Lanchester complesso di respiro dicendo tv momenti Massi Song One Million d'alto in questo enti terzi Binda risentirli son dette di Tizio metà poco Attu forti sì Sabbioni s'
Odissea infernale incolti Dubai di Mike contro Gino inferti Naim by nucleo jeans solo emerge proprio Emirates di in decrescendo tutti giunti Gino sinti Assembly o del funk soul Complex
So fare Perris notti è che in quel di fare X Ray il cristallo grafiche straccio obiettivi Complex aumenta tutta immenso Alex son macroscopiche sono stretti ricopre Xi visse metà polpaccio morì Ets
Metri x movimenti
Ente membro rende Betti Moretti ex era scelte e compilation
Deciso Falbo firmerò spara grassa con prezzo Valentini Kolaj complesso quale entity Bova in acciaio
Dis moniti Vizze
Design qwerty catalitica Keating di complesso risale ai
Ebbene McVey meni Sabbioni si squaletto pron Chu Occhipinti trentenni Shqiperise evidence Tecce Biscom Rex mai Petain match qua chi si Paik ritardi corso
Difeso di Forlì Storti sabbione Enzo opti Complex
PG sessanta ai venti fine di Human Gino
Dei protette nomination Piccirillo che esce di ma assorbiti recarsi al Potenza
Di City nei
Nati fanno diciannove something like Etna inno chissà più uniti Siss con Tobia anti strozzini sovversivi something guai che Setti fai promosso al più un x Richard oltranza più Units
Ora qui c'è un Rolex topi ai denti falsi
Per via Pillay consentirete Inga ore Research è forse onde
Esigenti New villaggi NTV FS Foa Piceni Coles Forrest Protti nove ittiche di ho avuti Complex di Gennai solo Chiti Tom Bronson faida per i precari soffro ottenne inseguita by one al Seventy fare binarie Sizzo
And Bear Faldetta
Disse il proteine altre corso di Percy polpo stories by Sarpi dipende propri incarichi sei
Pecce opere c'è alti interessi prodismo pronti
E invita afferrava Fighting di gruppi ne McKenna
Ai tempi fa Ettore il
Tu mio T-shirt Cindy Nuclear cugina in disegni diverte sfoci in il specie nel sole Piffer il fatto al neurologica Ortisi sentirli Disease
Rizzo perché purché fisico si avvia tipi di Ofcom flex su Anna
Dei ETF SFOR Gillis meta by faide Exodus indetta letti vai Iucci intra s'
è il fronte Human patologico riempio ventun esso Seba cioè di straccio pidgin
Teschi guai se il processo TG in super less di fanciulla Rollo Piccin di mia Passion su di me c'avete istruttrice avvenne sedi Tindaro laboratori sì lo so fare Sex di fremiti senza abbina i denti Fighting di Fendi risse
Il se Nurmi atteso niente feste Exxon
Peck c'è il se c'è cinque e tre punto afferma cottura di Stoccolma e il solco prematurità Happy Nation saette
è nato premature termination saette in Exxon treni
Pende pesto pliche socialmente fixed son
Qui ci sa fare indica poc'sitter il riccio in orti propri
Dati S e quindici NIS presenti né per il resto anni mal spesi S Goin'from io ma se Bova il mouse
E di Sorso presente insetti intromesso offrirla in tal nota adesso Davis di location cromo solventi che spetta Pittis nove
Denham Robecchi Songs di Massaud di proteine
Ai voti e saperi interessi Looking atteso liti Protein provarci che svetta e dica Pozzi termina Rigillo discoteche mis anni concert iloti Space
E dei PTCP Lucca alte di emersi pence dette e di di player Lisi detti di carta Pozzi termina Rigillo discoteche rissa AJ Lee conserte indulti spinse is
Petitti Simitis Capozzi termina ricevette canonico sarei cioè portò scurrile insomma ippiche ieri sconcerto Disease indichi Titti infette dissennati che in vale in serie in dodici espressamente in o di animals Pisis fatti sotto presentimenti Neron spara pensai
E Green
A indie che niente si pensi is città Happy Happy invidiosi su disinteressai sospettai OCSE e specie qui io costretto resa anti Boötis
E chiesto di almeno terminerà Rigillo di me cioè proteine
Handicap box in termini arricchirlo di prove ed i restanti botti Seghers boss di non posporre i letti tende Fosco riuniti forte sotto i propri
Da se insolventi mia tesi senza affetti distruggendo indetti si sa Tenzin Squier fa consistette in di ai soliti al completo se ritenevo sepolto Fosco reti espropri nuovi investiti di possible fisiologico Rollo tutti Foscolo insulti Sabbioni NSA il calcio ex pensieri sex perdite per carità cioè on
Stadio mai io satanici Mourinho cardio Major saudite
Empiriche Division Jussi ingannando i botti richiesta fosse fosse renne
Bettin di Complex Souvanna insoliti by cioè tutti elettroforesi su fronti Issel cardio Maya sites
Tech menti invito riff com'era Toxic bici sessista used to cose Massive in crisi di entrasse nel nulla lei parlò con salite nel Pd
In più si disse ma cioè i Nascimento di posporre Lash notti seri noctis tesa più uniti
E che ebbe Ibis si tetto corso degli usi in gravi atti foste it indicarti dei sunniti e un e i tre mento Visco mela Tozzi in più Seat il ritiro dei propri top di prove insolventi in vivo Tênis Apps tanto ciò il Foscolo invece sull'avviso proteine Antonio Ratti controllo possa anche che ampi
Il suo sforzo Sergio invia i soliti Frascino vidimata con Jan Bang Bang
Pure di posporre Lash nove di propri monitor Pati specificando ipoteche di posporre litica Boksic terminologica il possa presto va inibito al son pronti Canini sei e ruolo se tipo spreco e freschi o tribali di artisti dopo per me altri fatti Forsythe i camping
E di rischi fanciulla l'impatto il camping Semir Tecce
Com'era Tozzi in vitro esso
UE volesse dei botti riversati camping ONPI ai soli mai top class Fraktion così se il significante Nascimento appiattiti di opti ovvero la TTT o complesso hanno sordi posporre verso le sedi impatto Conti fanciullo http o del computer s'
Io rese senatore sperimenta i onde ti pensi al carcere Desario Falco Blast from ma Ones
Antitesi retta a tra export cerotti disse il calcio in stucco leva Tozzi
Per il sette progressi in crisi in tipo sprechi solleva nuove ti proteine di tecnica e di specifica antipodi
Norma Rae studiando i botti e che esse di Albino terminal sono dettagli sono Cenci tutti contento chi Sabbioni batteristi specifica e Nascimento di Foscolo Ellis noctis Sabbioni
Enti Sissa asso siti Twister parallele in crisi India CPT
Enti endogene non sarà ispirato reattivi tiro del nonsense siti pacchi VidiVici gruppo se segreti riviste Complex One
I sette il folto enhancement appiattiti pioppo complesso Anna sussidi spifferi in crisi Fosco rivissuti Sabbioni
Lauria posso fa sette e dissapori un'ischemia vispe significa lì di Fosco riti tribali e mai tra Consiglio spostati is vecchi significa Bajkal sia un
La richiesta non difetto è di calze lei per il marito al consiglio regge un'edizione di artifizio ai remi dietro genesi Picinisco hanno di match dietro Genesis ottica
Il tre Psycho
Detto Canzio ma i chiusi se gli atti fashion ombretti pari e dietro c'è adesso Bari Activity Inger posta dissi Cities di tifo scorre veti informo P dieci Pittis a tutti
Al fine di yankee che Tecce e nell'Hans mento occhi di intra Malta conterrebbero falsi che attrezzi semi Halim attivi Complex One urbani inibiti di fosfati is
So pezzettini Ainis activities prive link
Solo in alto verso ed enhancement e modeste naso in tal caso il vinti mai record metri x che è un ex sette più alla a chi vede in difetto non di opere respiratoria attivi
Vai a farti criticati senza Airi dietrologie visse entro Complex One
Dati sale e avvenissero Experiment in ufficio risorse
Il vecchio in Bova Inaki mai dal Consigliere ESA più unito periti nei che io Complex qua nei Fosco riletti ITA anteriore dei regali paesaggi Chienti
Disposto per il suo ruolo se tecnico Nesi indi interno Saito Prodi ma il racconto del SIN situo sta appresso by al box attaccati ritmici Wax di entri o praticati PTP indichi in compatto mentre e tuo son detti di Sabbioni tuo sentite Bona Fide costituendo complesso Albani tutti elettroforetica se Varese dopo complesso Anna
Ecco qui sorretti indiani solite completo Suardi Sabbioni i tuoi segreti Fosco riletti a te ti seri né di stabilito bonsai venti fa anche by e mal sì questo sì
Risente ridicolo poco ciò avvolte in Cambridge
E sui porti il tetto interiste Nardis no al Prodi nel complesso hanno deciso Fosco riletti by Piquet ieri
Discoteche visti solo Cocchetti esso esplode in senso di Festi
Almeno terminato resti di ossa
Poi We were presto si pire vesto CPP di Fosco ripenso al di sotto del Sabbione X
Pioneer il sei e l'ex per rivendicare da Urso Ondina ai soliti il complesso albo fine dai soliti Complett su Anna
Qui ai soliti il buy preparati diceva elettroforesi su di propensione di di Rigel no Bettin che i diritti
Diretti anzidetti espropri in sardo reti o lei Plebani radiati foste
An degli indizi foto qui Kenai denti fai al protein Bye Music Riganti Boötis il penalty ipoteche stia Mino termina Rigillo di Prodi
Grande ipoteche iscritte al box Intervita Riccia mentre tante volte chiesto di Fosco relitti forte in ticket indiretti Protein Was
In parte posporre liti
Blasi sinti sembra riceve it N qui e liuti torso di Ies esso proteina identico anche balli di gruppo più volte
Per gli all'ALAI Spike Mauti soffitti proteins presenti indisse venti lire
Pepe ieri disse e mass Peck by Mauti Toaff o di proteins presenti intese e tinte dipende enti utensili tetti in Peter lui vere e tutto ai tempi fine disse Bentley proteins sei Sabbioni sul complesso Anna
E al proprio di chiudi chiudi
E ISS proteine sue lesionata versa più dritto al completo sua tipi serpentina e poi disdette dissero i forti e tipiche ITIS veri Macerata il Paisà più unito complesso hanno io risse di Fonti denso di Mauti top fanale SIS rinvio che anzidette Clio lì di Mauti troppo analisi sui visti presto risolve al Protein di di ISS Pietro ottenne le sue lesso di Stroppa in o Seventy ve Ittiti
Tu c'è pareti protendono interessarsi Thouars fronti ISS se lui Applied tutti elettroforesi essa io pizze e se quel giorno i dei tutti a letto forensi stappa e turbati di allora reti se pareti by St-Ericsson Rezzo forensics
Dio che sigarette indie
Proteine OPEC Cicchetti privo di a e porto eventi fa ai al proprio in bici se caratteraccio by specificai sono eletti poi dopo una in poi infatti per vicini smacco usciti tra il fondo di e ai sonetti poi dopo DS e sesso dicesse che ai sonetti poi dove il forte poi si seguita sono altri tenta di strip forti Inc elettro foltissimo ai tetti esproprio whose intimiditi Fosco riletti
Solo in a doversi in tipo va in mensa e lui è fosco reverse no opposti Protein forbici Pierson disse fisiologico Rollo e Linate Respighi SIS
Esso ha messo di ISS protetto batterie interessi picciotti sia essa espropri che si dette e tesse posporre sono Saito ormoni inghippo fine Physics
Dei fax presso Sai Tricesimo acting rette is upset Front diate spinsi sono vicine P due articoli human mouse tratte di Athirson so ISAF senz'fronti in sette it's ok sorvegliato momento piaccia in quanto a stento gocce mai BT specifico Rollo tipo scorre verso di sta dicendo pronti e ti feet macchine sangue Inter firmo Bitritto Ascoli Piceno di proteine ipocrite by Digint Enkidu F. sforo
L'ha mai tolto io ho detto via e per le cioè San Simone va oltre TS CD specifiche Incident Complex quanto human patologici
Reale caricate le che Sensi banali Sissoko nove pece Enza affetti by nero logica alti Sources di sorta Suite difetto complete su Anna
è i sardi tre il mio testo il suo vice UVA pilu vecchie gonne qui c'è un EP McBeal Foa
There is di nulle e mio Tension Petrescu Anna di Franchetti intuite eccellenti pesto plichi di il mio pesce Enzo
Qui extra invitavo stetti soldi impatto anticorpi smentisce un suo atto li ho di straccio di proteine
Impatto ambizione Pancho batto corso e l'impatto un display sinché enti stabiliti opti trascritto Products
Da troppi Peterson Sui Kenneth spetti detto di mio Tension di e uccisa posti chi esce lentisco cento Sicilia qui chissà affetti di presi penso ti proteggo ciò sta appresso complicati di Trabacchin no di merce il proprio
Lato non via Tension Attis riconosciuto producer tra etica protein le proprie ambizioni diciotto e tutti amino Terminox Batt su BBC invidiato spaccia
Enti spesso più Priebke i sodomiti sotto il e sempre lì pronti proteine Enza Press di posporre istituzionali
Parco perché i conti e di proprio provocazione sulla Lesson di sanscrito sui fa un tetto vuoto spediti io posso compito di di Trenton di rio si capisce
Testo Volpi ex a minuti impatto pochissimi Tension soldi a chi video completa sua espellere studi rispondo sotto Complex quarto sai chi era Pitt
Da chissà nel match Lenzi from il controllo Human fai proprio adesso Diseases di dei pensavo a tutti di TBC Salas by il forte forse by saliti empi
Enti Keith invitation Stanis Nottola uniti Crisso punti normava chili dibatto si sforza presso il nome di enhancement attivi di paese sanscriti P
E secca un senzatetto qui disputava certi perché non discute il cent possenti Fetting di Assembly
Ho complesso Anna dei DS tutti gli annali si dissolve Kompleksi Sordi respiratori cene
Enti gli rese sì restaning il ombretti letto su reti Capaccio io ho inteso meno clienti sa più Rizzo Complex quando e di controllo poco Anna mai per contiene dei salentini
Controlli di Human fai dopo l'assedio che siti relativi position disse Sabbioni stili notti stabilisco Boulez quando relativa tutti sapevano insomma Complex fatti
Powell ritenuti Sam analysis o materia lo attende fronti chi Patience
Perché Sideri Settis ha più risorse Complex Wunder Mboup Closer tutto Solza più misfatti d'Pecile in specie venisse che ti presenze indiscrete siti specie soppressa Complex oppure loro momento proprio qui c'è il PRIT Nature Complex
Solita doversi sì strette di pretese si sa affetti di Assembly io ovvero la sempre io Complex One
Esposto c'è torso griffe specificati poco disse che gli studi è diverte SFOR proteine super lesso l'antipodi destinato proteine
è lucchetti artisti Bruno lotte io Tennessee tu interessi Teachers del sesto anno i sospetti di così Porcia Sabbioni deciso notti in pochi intimi tensos Mou Rosa su di Sabbioni sobre altra pizza Sabbioni soft complesso fai Davis confermi dette risentì Fetting assenti
Lazzati secondaria spetti il fine di is the cioè e Lucchese Azzi proprio in Unicredito guanti Boötis
Nottola di campo site Vito rinunciando pc sul tema pinne s'appresta invalidi invitation sua smise Inc batto Orso di a meno e terribile non arriccia interdetti banchi spesi ficcanti botteghe est di almeno terminal seccamente solo in alto verso disseminate esce se ricevere specchietto Omri
C'è un colosso il San che esisto anch'esso di proteine
Quercia appresso di acquirenti sopporti proteica un prezzo Anna ed discutesse un Sordi climi testo super imperi di asset li ho completo Swans
Sono è che le i testi etichette tipo contenti product Totti entità F. Sforza i Simple impegno letti gli atti di Dio Complex quali vai di Sacrespi caschetto
E schegge invisi importi importi ha sempre gli occhi Complex e nel mio testo sinti proteine i di Lezzi sei di lettere ora Exxon s'aggiusta appresso o il sogno di aprire insomma di Protagora provato di First Exodus
Bravo Pietro Accorsi tu a Novalis tutti e Messenger armi o preti Gillette
Del suo stampo by Nordahl plotting sue lei Sbai real-time IP sia
Direi sentirle per lotti canonico ormai trascritti in tilt controllo
Perché insite Tinti Nurmi e pesci adulti pretesto un affetti ed il testo Exxon i transetti se il presente attempati se non è per lei sentì controllo
E chi sorso presente i righe sottili intese non se così che pesto pliche Hirscher lenti efficienza Exxon batte di a Repesa appare lei messi veri l'ho letta alle in
Di transiti Trezzi del pesce è il discorso confermi bagni real-time OPC are sordina doversi di Santo sì stretti
Posso panetti smettesse tutti sappia sfrontati check out
Dai chi sono detta al want it inghiottiti di Spitz ischemia di scritto Franklin top vai e prose spicci scopo di nonsense mettiti Gliqeri
Da Altis prose se camping eviti fai inibito la soap Protein Synthesis soldi c'è difetto oppure ormai simile quindi impropri Synthesis hondista appeal ritiro disse trustee
Ente io intensi vecchia identiche esordì Patience Carrington di Sanche mio Tenshinhan
E Transit which was a accento indiano senso puro mai si a Pinuccia venti Nm attivo soppresso by Couto mai sindaco
Entra a Pont Ricupero puro ma il senso Activity in Camp Protein Synthesis e che enti transiti Sapir sono rinato vesti assenso di Prodi is you tu in stabiliti obiettivi utili tit
Pochi vestiti TG Papotti esibirsi preceduto forti altre mi Intentions
Bravo Picarella oltre
Per terra analysis riferì al tai-chi sia etiche insorti Patience vizi di nullo Tex dunque
E facili tradita nuovi contrasti Tours presente
è il motore di Stato Mostek in atti sotto di canonico oltranzisti et ventisette Hitchens è nata sassi tutta Pinuccia
Invece ruolo senza Paolo Maggio denti canonico un uomo Guanda
è vai si pensi Tisch materia lui Fantetti che esse Issel Twice varianti proprio svaniti in senso nobile cripto Exxon dirai di from di sei continenti ed invito interpreti Sonia di sì penso visse trascritto vice presenze il canonico guai in Saks
E a doversi indie Nour specie tutelate conseguente insistette anomalo asse il display variante a piercing ti segue
Pesto eterno via presti point uvetta dischi Spruance varianti ruolo se il Proust
No consenso opti mio deceduto o rueda display trovare il suo osso corretti presentino Theatre vicenza intinto il controllo
Va posto lotta Hunter Cognetti Lipeck vai di nonsense qui TTT Kay
So qui alcune Farid di Eric giorni di inside iscritto ai sommi Pifferi riverso prime estinti Fitto regional ente che foro accesi RAI Mind teste ex ante
E vai real-time vi sia pingue Apple tu fai
Indi pesce gli scritti di Newark detection esatto Sancho la Maolucci Otis
La George Twice varianti detto Piccolo esso di One più tutti sesso notti scritto Exxon
Batterlo soccorso Chris molla ti Spice variante specie Wasp di hutu in senso non Richemont su molla Pacciardi cripta ex battesimo intensi io
E io sì disse real Time amplifica i sono di specifiche Ricci una boutique infetto Exxon
Peace materia lo scorso il presente io oltre o in molla a Mount in di controllo in di dopodiché ittita entra anche i ticket i pittrice sorvegliato questi sex perniciose
Pettis Twice varianza exploit hanno
E subito esso del laissez faire Spice variante qui Cis di hutu esche quindi Exxon Chu
A lei Orso presso enti inutili normal Samp checks esso wireless Cindy cadrà vicenza How Eva il di norma non sa accetta e super lessi inviato il tuo pc anzi
Tesi Spice vale il sale Flint of by di nonsense mettiti etiche guai istinti teso per di più il PTCP position ottimi atteso un apro pizze e si importano mette dice o un primo vinca ammonticchiate spy story senza sono austeri Lina Rovers editi esattissima all'information esigibile & più essere sfocata
è proprio sit-in human Eastpak spaventa specifico fuori un manzo
E Namba ovunque variance di estivo hanno ex di turno è estintori
Designo danzare normali Flint of enti contro Sanchez solo dei e nocciole producer ex sei uppercut proteso ora hanno want it transizione guai se di mio teste di feste Exxon IST a protetti disse nonsense pentiti di che enti ictus intro di lusinghe Fert complichi su ton Aurigae Nantes spende qualche testo ITIS Gina sottecchi mentre forti io Bands
E TC sei detection sui Cissé Corsini di Disease indizi Omo si costeggia e se apro che i tigre che resta un Complex quando vai ti sai che i tempi carte intuì ci speri import meccanici tua da certi NC metabolici tutti e legittime s'tesi Cinisi importante forti assente un rinvio di complesso di Integration Between ti Nuclear jeans e T metro continua Genna
Enti nartece in porti Sitchin indi Grumman sera Spice Baganza
Pc mai Prodi usando volti Products battezza Clinton vai di nonsense mettiti etiche ove per Detection spetti di feste ex ante intro di sorso di Sperto scoprì che inciso difetti gli assenti riapro che esce uno di atteso EP Complex by salì Chienti
Ente attiri sentisse l'OPA all'want it proteins entrassi storici mai interferire nottolino visti assembly Espresso complesso Ambato mai che ha disturbato detrimento al difetto
Ordini scontri più di tutti se periti o disse
Del pesce russe Fantini Juventus perché
Anche Crema cedere utenza ma una a rispetto il caso per fuoriesca cent'
Do you carte Experimental evidenze stette disse specialisti invarianza a a un fuoco Ford forza il Senatur che incontri più Totti
In pratica ho pensato proprio
A nome via sai tutsi rueda di quotati open reading freni russo istinti su quali varianza
Tende previous avverrà al Potenza
Papà io sentissi specifica antiporto is
Pierre facoltà perfetta Ettore e di Pierre Massobrio Bauccio
Serpenti nei ghetti
Pece rialzo Mennea Igor pecco di qua insomma rischi più eque specie e piazza Holley Uif di Antibes voti e chiesto di non posporre l'etica Pozzi terminal Ricci
Esperta e chi si presenti intitolato al Sir l'ex Sacchi chi sinte sites Tinti Saitta solo ai due agenzie Battiston otto assente volge in chi match Complett su Anna
Qui fa Specter disse per Tahiti se provato troppo è note nel reading frame Candy estivo Anna
Va qui al Tour confessa Roberto importanti Sbai ma spetta da iscritti sentite prova Tronchetti splash varianti perché e Tisch messi in che di leader spetta ai Sonic Carlo di importo il marito al contempo e sette incassai Isotta Saint-Paul e macché Inter phylum rischia sempre ostico stipsi sembra ipotesi
Essa al al copre Felipe qui
Quante le querce
Isacco momenti aderenza
Attuazione Comes suoi se non con il nuovo nuociuto Zorro cigola ormai in qualche mese è un po'per il nuovo offesi oggi Ocampo Expo annuiscono ignora per Enzo Paolo grazie il set
Cioè se e come verrà chiuso in attuazione FAMP ex lui figuratevi
Adesso grazie
Perle venne report se indicherete invecchia e
Quando il signor Pesce Hansen
Di dirette sfogo tette India ex sei posso appare affetti in corso di Assembly of compro l'ex tre
Sonic mai biposto e Voltaire Samo disse suo colto super numerare Sabbioni se cominciare in porta indicasse Empoli ovvero il complesso anzi insiste con si pensa più Complex sua non mai detta Saint-Simon Samuele affetti assembliamo Bennato il complesso di respiro dal recente
E CISL altre importanti dice sì se i ratios Sordi Kompleksi se esto Brichetto Green ex vale il sole Juanes niente difetti per respiratori censo Daryl Same evidenza Fortis sono doti sesto Beastie due spetta vecchia
Vecchi somatici
A nel spicca espresse ESO in a affronterà la Roma ci riesco enti vita che ignoranza opera ma che nel suo insieme stands Oscar nel progetto
Anch'io professo Butterfield a cedere AMBLAT tocca balza meccanismi sax avverte in stanza Stander procioni
Apoptosi scopro che non stiamo bene che ancora sul chiudi Instinct pathway siccome c'è un arco di estremisti antincendi secca pazzesca cui c'era attive che pare differenze stime Rai
De incensi pathway ucciso soccorre mai tocca anche al Papa i i fatti venti Melilli Bayside Tatozzi Agency RAI viene da Majin trans
La dottoressa Claude risata patteggiano XFactor sfondo mai tocco anche Alfred Sant costretto Franzin UE cito che adegui caste strane a Corfù ANFO Lanza straccio conti a patto San cui cinta tedesca Space Fritz U.I.C. l'istituto detto Perseo
Di ExCeL Settat Wendy emessa attinente baite altre sette Horse With c'ha Chas membrane questa attraversa ed oltre indios edotto siesta
Andrea diretti verso una Beppe sette Bye Bye mentre dall'Huygens liste de Formation abbassata classe mix traccerà cui Cesco tedesca Getting Sing Sing dall'incompletezza
Unici Actinvest Dini scelto Arca Space caste sei tra cui centralizzati Bates Caspe stupri uccisi ex Krishna
La Space
Verze setter Stabila sulla famiglia propensa cominciate in Karmann annuncia sento a casa nei confronti sì quest'cui ci Scott testualmente dica sentisse Eriberto eccelsa diresse sì NARS protette indossava s'vai atti Bettin a caste a caschetto cast Peters
A Witch esce clip strane Nissan sette inside se erano saliti in tu hai tutto se essi dal best character Rice Number sapete a tre sette fame lenti
A c'è un netto si è sfatto riassetto One UCI Times tutti in manette disfatto raffronti sedimenti fare FAS UCI maestro tra strani che anzi ancelle sette allora umane su cui ciba entro cioè il nato c'è il e si importanza di classe elette e ti sei molto ingiusto edotto stesse specifica lì in mio Plastic Seamus
Balthus noti norma assassinati essendo maggiore il tiro norma Seamus sono e che Sly pietà attento e più c'era Rick diossina e che Antici amareggiante
ATM incerto players stanotte ha portati promesse senza e perseveranza a a Melina pensa switch alcol cast Presence unici stanze spoil system frontiere stessa stessi fiction Raspanti casse presi Tiozzo
La stesse essa a presenti o Perseo s'ah sì in atti Records
Unisce appannati Vescia mi ha forma Active Tecce a Meireles U.I.C. a dare risposte Bol poté chi peggio opera Annan però per Saito Plaza Nick Cannon Pier success
Das Lied into The Artist mantenendo avversava spento e tutto si disse
Fra Sparta ormai tocca quel presenza Murer crea on stimato pari Ethics Cam sera ossa
A asino inviando io We Can't Fight Club il potere senza s'Guerrazzi in viadotto cui fa and more specie Rice stanze alza
Poi Samp stimato Poetic stanze Aus Witch Candy fa incetta di Pinto od carenza Obama Abraxas
Dischi M ricapita lei stimato prese semplici sempre maggior Frontières Bangui centimetro Petites Stem Cell di Francine X intriso azzimato preti foggiani Travers mai la ed o linfoide
Lui cento maggior intralci matto poeti percorse antenne grati agli insomma ce lo grazia ossa
Odissea ossa a atti veri e propri Frey Thing come a casa fine al Maccio grazie al solito il nostro riflette guitti exceptional parti dei tetti linfa Sykes
Vi si esibì Experimental sistema wireless tra stati stimato Proietti che stanno in più e Gianni traverse Houses
Quattro in giù e sui teca Pereira brado cordate
Anzi adesso lei provvede in mio normanne Marinetti prestigiosi as molto più lei Sean occuparsi di tratti for positiva Seamus U.I.C. contento voti ematopoietiche stemma entro Gianni tra Strauss
Visse scambi Grom in calce in essi Confin medium interprete senza stessi texani tocca in Combination anzi
Clear and ci troppo più lei scienza ho chiamato per i piccoli geni Travers Bilan vinto del cranio asfittica mega Calessi etica andrà eritropoietina in città
So che vi è senza dubbio venti euro più le chance Obsession Manna fine marittima tappeti cioè il centro il Sas Duffy castrati gioventù accorsa Fabi francese
Decisamente Stanton la otto davanti a Maccione esce dalla porta e Detroit progenitore il Sir
Anzi essi vessare messa spiagge lì di Franci at Amina Balthus Weeks it excusatio non più il setto di Kamm ama cioè e Rizzo Plas in vittima
Assenti clandestino Quetta mega prestiti Xerox UE cioè ambientò prendo mai trovo sestieri Cassi sì al nucleare andante forte andammo a Andrea insinui Xfce Petit francese André Straight Plaza nasce strutture Tears Play l'ex
Quindi le stesse Vincent bisex Clemente assistant
Testardi del sensitivity otto si umanissima tappeti progenitore Alsace ceduta a Porto stessi indios baita cioè sette URSS poi standard sa Wael Raniero Citic cioè Gianni Trust assensi Tietto Dutchess attraverso su auto ma cioè Jean mano Citic progenitore essa altresì stanziato altri ma crescendo
A differenti di tra Gianni trasporti è il trolley per anni opta mega carestie Citic lignaggi
Assensi Tito depresse attraverso ogni in da First Faces o Maccio crescere e vince Sting lì dentro è stato estimi fece non distanza
A i sei Broletto in giro il sacro riferisce Anna animazione Jean arresti
Quindi intanto ed Earth si attende in elettronico progenitore S.A. Ones Stingray che quei pezzi e settore Lai che anzi sono intendo che assalta eritreo Plast Ghiffa indaga trascrizione al context cui esce e scomposto occhio biscuit salsiccia fatto nessuna Keith wei è e li trovai stessi che caschi e c'ha fatto festa laica Taiwan
è un disco ex il suo espansivo il forte cioè a Schettino o o jeans Witch annesse seri for elettroliti però mentre quattro i fans
Anni Arrigo Quickly polizieschi di casa X-Men publish
E senza istanza Destination ha detto estratto on in Maccio ora e che ciò è foggiani Travers
Liste Dianti beige o no caste sprint anziché stipati clivaggio forte in Maccio in atti formali intriganti forme antipasti iscritti detti ormeggio e ci ha scritto un patto nel se sei fuori Freud ma cresce a lui va lui c'ha e sia & Gatta One sia il casting presentano ante sit-in anche file per anni atti rating antipatico
Del ci ha scritto fatto anche di credito
Esplose scambi blocca baite presenza abusiva due C sette accertata che ha steso inibita anatema sette intatte Pro Sesto essa indica Space dipendente
Sono in Double Mauro De Mattia bresciano o per il club SEA sta ok inside
Anatomista faccio switch a coppie e vetro plastica Highlands invece in Maccio e Petrobras avventurosi incantate Kuwait ma cioè e Petrobras
No in azienda Maccione Petrobras express del prestatore like talents guai in maggio e vetro plastica X Press depressa attraverso quanti istituto proteins cammin toccante sia usati arti Vescia no depressa attraversa antica spesi atti pesce infette in Maccio e Tracchegiani trans
Descrive state clivensi otto ed traccia schiaccia un fatto Escatha One e sia Taiwan dissidi visto varie vestibolari resta approdi fashion è indifferente se si esce va be in Maccio ora versa amiche nostro Sun-Times Little sarda fluente andai dal sapore rétro poiché Melinda Pomaro appello destra che a Messina Asa feedback meccanismi ma by invece eritropoietina e scambi reggae lei tenta abito a sangue nominarne Xemnas o Maccione e vetro Glass
Guidata dette sette lycan se lui ci Glock petrolifere Jean enti fra Insiel Jean oggi in Maccio ora grazie allo stesso a disc Candy è Huet negative lieve Klett stimato poi e eritropoietina e sa esposto Tiziano circa il re Juan Enzo
Thunder disse moda ansioso d'incontrarmi e in Summer animale moderazione laica sembra che esce
Luigino del disse calcio il sistema ottima tappeti progenitore ex o sotto innesti che Basie essa otto anni Kim Serpi indios anni Mia
Ah sì mio animi enti e specchi ma tanti esige atei Command side effect Hope Antici ormai terapie annerita Sexta baltiche siti Syxty per senso Patience Vezzoli CIO Max
Chi mantenerti inchiesta niña list la ritiro Scoditti appliance Zampa in studio dei Interaction apportati
Presto lui alza la stanza buone unici aspettare che ex occhi mottetti inchieste niña
Between decimato preti fagiani traverse Houses solo lui comperate sensitivity tocchi Matera Chieti Chavez otto in Maccio è stimato poeti progenitore sassi detriti for passettini Bissau est
In ma cioè e ritrova il Progetto avesse distanza & Maccio ora e Petrobras
A lui fondazione in macho e Petrobras
Alberi Sensi tipetto apoptosi stipendio specchi ma a tratti etiche e Hitchens se lo distanza a probabilità e parquet se Hope un attimo a tratti indios Grazia deperisce in vivo
Del Minas esisterà unguento protette di Strauss from apoptosi sinti o specchi ma tre più ti calza
Anni fa da di Saetta Caino cui Cesco distanza il fattore & indispettito Sbai stroma Serse non pone marron
A by step sì chi tra il sette e lui ci espresse antepone stimato Proietti casta nel progenitore Stars
Vissani trattenne est e Igort protette è il traliccio Gentle scampi Porto si è sentito specchi Matera Chieti agencies chierica anzi
Entra il Progetto versarsi Guicciardi in criteri due sistemati in in via senza sostanza fatta ora in depressa Spal stanza fatta n sicché anzi Sas intacca la stessa stanza al fatto a Brema ci Protected from The da mance
Infine Sting lì info Guido arte sul destro Chet mentre lui il Tarchi ma tre piatti già qui washout da junk
A ad concessa se Guicciardi no vincite due stanze al fatto che Continent dai una casa in bocca e senza Ostiense il fatto che versava s'a
E fin troppa interisti misto
Va ok
E da presenza stanze fatta addossava sarà resta altro dal proliferare Jean differenzia e Jean
Anna di essere affetto da esista e importante e Descartes One Day ti piglio distintivo Ford Protection troppe chance franchi mascherati indios anni mia
Lui preliminari evidenza da a stanza il fattore est Able to protette fronti Mazzetti nato come li elettronico progetta versava s'batte osso nega ai vestiti & Ramiro monastiche tra gente onesta
Sono addestrate maybe teste in vivo di affetta niente io da o Protection tuo ex ori stimato preti progenitore est in Patience diventi una intima terapie occorsi inizia desse Knicks anzi Tessa anni animo al Max Madras di foie
A salotto concreto Affairs parti sopravvisse otto affettato da a sacco di ogni linea ci faccio assistant
Unici a lastre stabilisci un Manna a trainare intimato Proietti progenitore Sas Geo incontraste Gestob differenzia e Jean
Questi sistemi unica Femmes d'atti d'altre sette persone Amin Warden annegati pregherei Jean o per il troppo Isis o di atti pesce hanno otto infra se allora cast pesa e Anna e chi invece hold em Freud ci ha scritto fatto verso io sto fondarsi in maggiore e l'intro Blast ad targhetta stimata inchieste cotto stessa entrambi protetti e baite assai Taccani nella stanza del fatto
Ed essa gran parte ma intorno a a quel presenza muratori Dan ogni ora sta nel frangente perse Houses distanza ha presente boh inviando io inviato colti
Tanti anni fa inscì Etsi Into ignoranza asse sites Annibali godendo Steinitz
Adesso lei tende Unione sta nel Progetto versasse fra ma addio al Factory Barbara otto oltre emblema Spinnato Ones amianto temi in calce in calce a distanza forma di rospi s'cui c'era anche ricchezza ovvero a atti istanza se armeni di un altro genitore s'U.I.C. express dal Marche Nesta in di Starsky & Franci eletti in vincevamo
In tre gli euromissili Canzi sia in prime andrà Aster Sykes Andronico dentro stanze
No ITIS no Dazzi indicò opinione senza Scalmani Great sites aventi ammesso nel Brenta Maggi
Andrà Able to strofa et di Francine i cantori playlist D'Anna C Sas Ina mentalmente come ci è stata invece Ina potrà txt Milani laiche infiammatorie Said Kais Kodak settori mancanza sarò a queste che lei tenta senior project Sas Max di dai resti stante la porta txt Melani Anna lui quanti tre investiga at meccanica sì ma ad essa resista strappo otto Siss
Presto Vietnam India ex tranchant ho depressa attraverso andassero espressa opinione atto già interesse Houses
Anni fa una significante expansion al sit-in anche fare cancellasse torto & al nuovo Splash nocchiere statuale enti Anna fessa trovando a guardare web qui al Tibet depressa attraversa ognuna progetta la SARS disse al sit-in qui in a completi resistant la porto Sissi indios by depresse attraverso quante assenze Thief tu apoptosi essa indios Balestra rospo venne cui c'è Active X in cinese ch'manca Concert pattuito cappotto SIS
Sogno per gente alzarsi a completo esistente tu apoptosi stipendio Spy depressa attraverso
Salotto investi che risalenza dessero resistance Willy otto abbellendo spavalda Magic players avviato Toti programmati vecchie baite a tre sette as sono quello that's cast pesa Etica stesi qui è infatti in Borsa adozione tende embrione che mira al project Sas
Quattro I Found Istat Castelli Ezio cui certe Inici et Arca stesa lotti ex ENSE capo tattico Program e scompiglio etici assente dai Bozza ad oltre Ennio del Progetto S Hamas e cesti implica spesi sei se Isa qua e by fissava saggi o indifferenza si esce al anzi Mazzini Bae a attirare nell'erba standard proteina dal Andrea disse Desert Sean DAT DIA acquisisce nocca spesi sei Tel esasperati che quote differenzia e scende in tre New Orleans Baz notte in classi a Science
Win addosso comprende stressato se Ina semmai Gucci sconta enti su cui ces dirai fra Marte Attoma Ennis e inoltre di francese che indice INPS ognuno Anlaids Seamus
Posso impianti Trustees atti anni Franci ETF i circa spesi sette esista ormai assente uguali Six Pescione in Christie's Web differenzia e Jean indiceva
Atti atenei andate Protti intanto
Stese x cambi indietro standing al Progetto versava ossa by e adesso accodi infiammatori Saita Cainazzo qui CIACE umane Cases fatto ad Alfano Inter FIOM gamma anni incarichi in quantità
A ante osso perde altre sette al sit in anti faida e s'affretti lei Tebaide sessanta Hymns
A guardare a Ivan attuale
Ma CIT mansueta mixato infiammatori Saetta carenza esso After Caspe setting dacci anch'io raggiungendo il Salsa hanno Sensi Tibet da tre sette le stime lei Jean
E si sia dea complichi avesse istante UA ed enti scritto di una di organza assensi Tibet di Kansas City chiude cassetto a panca spese at escalation
Sarò queste chiedete per nei castelli Sezze U.I.C. il sinking signore ottocento versasse ISAF normale o no Function al sto qui ex sono generazioni ex feste caste i sette ignora il Progetto S Houses
Niente detesto quindi tra Generation lenti pare ha detto sta U.I.C. appena vendeva la tenda innato Bortolin
A lui cioè Able sito Chance io scappai Hassan servus RAI del MIUR progenitore s'dissidente del Sarca vinco Strutter in onore della detto express borse di Exa ACEGAS jeans ed esche esca spese i trent'andare reporter prodotto Gina cui cinese e massacri Flores protein
Sono Guicciardi stilista danni ora Progetto Perseo adesso lui atto di Société dagli euro spiega intus Monio questi arresti
Andrà a pompare lancia sta crescendo a un miliardo a mix cioè otto accesa giusto Anceschi ossea ossa
Banche ostentava cinque canzoni sarà un saldo pesi e stanotte ho più in foresta impronte né ex Crescent Assa Abloy Carugo Marcona pioppo più lei Jean occhiali Studios mio un'altra gente per Strauss
E nessuno è in cui io pennacchio Clay Jean ognuna progenitore Xpress vinca stese ex accenna Scars dei set molesta dell'Air France OCCAR spezzetta cui ci sentire Sbai da mixato infiammatori Saito Crimes
Balzo osso Witten ex agente Asca ha speso sei cioè di un altro agente NOCS assistito complica le resistenze suddetti gessetto rinvio Statuto si esplica anzi si era inguine
Sarò costretto a te sai Stati disse causa must di massima annata meccanica sulla o Protection bissare Pia senza Kasper sei
Salumi ma intanto in lotta per la danza Albert situ ormeggio inibita versate altre sette essi Galindo cui CIACE Litta emittente
Lui ciabatte va inibite inibite in caste sette attive Jean atte a letto otto e venti in via Sensi che dall'incontro X
Dell'andazzo afflitto avvenne il logo ignora il Progetto ossea ossa guaio qui found mix indicai ex Fashion OBIS proteine pezzi UIC stanze sporche ottenne che invece indaga Vitis a di specie notte il Ivan Haider Dante fashion attende in a a anche jeans Airline c'ha stretti e dunque ex oggi hanno spento sopra ed expansion il mio occhio Gentle Sas
In essa Willy impressi
Ed ex cresce nel mio progetta la stitichezza Ivan Apprendi lei chiede interprete senza OP infiammato rissa intraprendesse
Se dovessi esperto Wasa cancellati in testa N e che Code inibire depressa torme di eccessi Guns qui indiano prestiti Teti di credenti in Dio Sing Sing la l'incompletezza atterra sì Dina enti fai attive Jean indie rock Gentle Seamus
Quattro I Found Istat tende e se da presenti il lancio Emmaus indi atti vette ed Visca ante According lì direttive Sciacca Speri sette e si Extreme Grillo
Venne Hawia Asti e fra Penghua Speyer espanse Bortolo destra Protection ogni ora più gente ossea Oxfam una Dutchess apprendistato Tosi essa anche il check Bess We Made accoglienza cioè tra ovunque e anche senza sì di N Klondike lenti pari al vecchio vers
è un virus riscossione pittorici addio s'dietro al Progetto Perseo Hans Das opening astronomico finisse indagata Ortenzi
Botte in Besar condition atti accettamento guida mix open chiamato il Fight Prince
And now fine avvinta degno del Progetto versato sta Dickens Sensi Tibet da tre sette le inchieste apoptosi essi oneri in presenza ottetto ante senza sottende SIMS ritto Byrnes possible Fortis Protection opinione al progenitore Oxfam depresse apprendistato otto Siss
The concretizza comparsa cui Fund attiva stanziava sfata il tabù nell'angolo Protection Against apoptosi indios by del prestatore umana e piazza Enzo caste sei tre
Andasse ecco anzi e sì dai a x Casciana ottenne
Sarò di senza medito Pisanu Why Mirror stanziava Scanzo vai inside salvaci il signore dei Generation distante presenza infiammatori Saito Cais tante file Sutter tre sette ormai che anzi e dell'husky minimizza a quell'incendio spettanze Auckland sarà stanza sia stato estero
Casa stanziano Sabina e venti fa ed in boschi mattone oggi Casalicchio Maurice è una tutte birre spam Symbol forti umori ci Marcel finium al & Regeneration od Pacioli di Crema cette tutti o forse Aus
A casa stanziarsi guarda apre importanti enti che esce sporcati di calze anziché all'immagine azione vietate e l'imminente scarsa Stense Houses UE punito dal pesce nord CIO ma di cosa del ci ho mai avuto giustizia cigni varca passi tempo differenti a tratti da da se no chiedo casa stanze alza UE no profit c'è un valore gramsciano
Caserta senza se in salice Moressa detesta i denti fine pranzo scarse
U r action Dax o libri in giacca Chanel avversi di Twenty four mai Vespa più cresce no casa stanze Houses li cito de Formation abbracci o meno e mais
Qui a Carlentini working on Cancer senza se dirai fra un principio Mars Express ce li glabra stomaco Ennio Rota sto mass distanza formi uno spiazzo in calce U.I.C. dopo vari mascellari da norma ignoro Spears
Awards mio Plastic Niro aspirasse Grau in carcere Twice marce aste normal Agnola stanze Houses
Di rospi Heras Devine from principio must a osso resistance to eliporto se essa inchieste Bai Qi mottetti ti che i Gens
A
Spencer spiegai Frundsberg Laio Blast Thomas di francesi invito ciò o quelli in astro Sykes qualche norma sera ospita in ceti o o segno Rance Andes proprio dircela ex armeggia altre scene indebitamenti esce un programma ricorda perché cioè strade stagni una stanza quelli totalmente otto terapie sfo Princi on Mars di caste ammette le difficoltà tutti feriti
Anche lei ha avuto giustamente people fu di due raccomanda di una stanza Ferrucci ha decide chianina Francesca Pedini
Ha avuto tocca imbarcata ormai Department Cesare pesce no scorsi mai supervisor Ruggero De Maria Urban forcina picco no dissi al tridente di cosa da Simona silente pentito
Vecchi cremasco prevenzione stenta Venanzio il presente e ceduta dai pentiti fine omette il senso di per nate in quel senso una rifiuto ai si Arsic querce Strumendo Juan Ciancio Cipirrello
è un intuisco Ance ed basta presenti ai cinque esponenti
Se qua il professor russe
Mi scusi adesso lo stesso s'avrei previsti Paolo Barile questi calcoli professare capisco anche vita in avanti acquisti Cinzia protegge nome ex handbike oggi
Alvaro da inchieste diciamo in rosso indispettire chi non legge il professor gentile Nicola denari finché Mary fine vari metri faccende simili Soru Guarana ottimamente dei testimoni chiesti
Fax questo balcone vale cioè fino a oggi diciannove fa stars del Pio ampi Teresa
V
Guardie Susanna ben Medef cioè insieme Faenza eran per quello che c'è chiaramente sessanta di stare sul cioè il gene qua e anziano e non vuole ocean why
De is sopore Espen qual è la merce sembra operava Marco S. spezzone accende volevo Angelo province nome ex guerra equamente Genome ex l'imponenza sta varca Ciancio ceceni Stowe Luigi by accetta oggi che si attua
Ha notato dat espresse che Zeman prova ricevo ciance nome che senza eccessi male perché poi
Andare la derapata destra e procura Candy acqua
Sopra le scocche in
Degli esercenti Janet stesso adesso vai riesce ad est di action test più dieci Masciola estensione fax mancanti dei sensori che in sede
Cerami Samuele legge molti anziani ex vengono nel New Ars Pavol vai argentina quel Simone Pepe Gesù in Canada chinatown Brizio a ma Mancini si arrende ha detto Francesco
Qui senza del quale serve anche a voi Cuanza guerra
A guardia di fine Acciai cargo esterna del me ne più aerei cioè il gene Finance a
De Square sciolsero Hoxha a inveire a farne US amante fine cioè chiare Goya per produrre il senso dei suoi di cioè insieme cioè strati cambi camoscio Hayes
Dico in sede test Hoare avente sesso Pandev regolari si erano ancora personale queste stanze
Che incendi regna in piazza San in sette prese stanza e nero che io riesca a mescolare pere Huracán farà uova dei cioè cioè il gene cioè se voi non producono farà code tatuaggio Idario Ueno era stufa e di recesso a
E adesso dove lavora avanza ma aver cioè sorso Samoa dovevano fare queste gesta rispetto tese del cioè x da
Pende forme quel risentimento tiene Max
A
Gestione Sensolo Bermone dette Olanda nel fare ispida prudenza quella ne sentì un braccio deca pingue Canciani Groenink spedì al tappeto travolse c'è un bacio batte stessi gestori vuoi che c'è una battaglia cioè i test prima ci saremmo anzi ha mai mentre ingestibili provare acqua o ricevette dette espelle proibì suona il suo in mare a fine laicamente in gestire unica stare ISPA invitò in quale ci Vanessa avanza in cui ci può essere Truman Show hai scritto questo indice medio a Valerio by theory esplorare gesti Boatti approva Vincent se si crea quei processi impotente Reichlin
A chiese province Scuola Holden Once anche Motion seicento vuoi dentro attualissima questuanti a mire sul web Enchaîné genetici Mediaset senso messa in mora il Papa desuete però a e Minghielli missili tema legname Regis mostre Daisy dei corre coccio fax ancora jazz accentrabili Bindi vanno escluse strinse entro Faia scuola
A
Nato il cane che c'è tracce venirne seria a Pio chi fa uso di sì sulla campi Ochoa oltre s'è a pranzo wards Kameni & Pieces
Se adesso il
Insieme del samurai Affi Hoxha USA Inferentia Nettunense by vai in US Waikoloa Hillside rende Pio castrismo e circa se Cescon Enzo è bene mi fa guai ma certo dei
L'attribuzione Gene Hackman Scholz esce stecca queste qua in faccia vi hanno dai tuoi Schnabel sette io chi fa uso
A fuori con il coccio Cavazzuti exceptional c'è meglio a Mary Fiorenzuola Sampras occorre coccio pazzesco vede Now sia un falso acquisti Guarna morì sua reginella tue
Pierre-André sociale e civile
Solo sa UE se in cui ho minaccia marcette veri quelle coccio fax andazzo ossa due avvenenti e fluido che attaccare nove a
A soldi azionisti Number esausti offra o sentiamo esporre fossero fax a venite in sede a pranzo emerge Nineteen mai viste queste per l'isteria impresa M acceleri M sei l'area
A dentaria quattro ad Atene senza tecnico anche Savo con Arseni ENI Weah impegnato acceleri Ende propria infanzia netti
Porre coccio fax
Sono guarda densa Amodio visions delle squadre o in azienda a cioè veri a one riesco autoparchi promesse dei e qui venti Abate
Ora il coccio Palazzo effettivamente Iossa e
Mary che fa Foppa e Sempronio in the fra vigenza imbracciano guai segue ce lo scopo vale c'è un po'estesi deve fare Spena Stommelen Fregene poca Nuara aste
Morgan se questi co.co.co. Acerra non i rari States
A fuori poveri o fax Frodo e Samp guardie farvi senza il volto Meani proemio dei focolare Simba e depura ora
Era un uomo cioè la membrana Spartak Lapponia testi Choji Emma ma propone una può essere fra tuoni fare petroliere ex
Enzo di de sedicenti attualmente cioè in genere fa papà cui dubbi Serina se è vero che questi Wang e venti dei ad improprio insomma che l'ex senz'auto de pesca invece esserne Whò
Garden lui senz'guaio in azione in mora dove c'è lei ma anche Rex attenzione se e quelle cose dieci
Bravo esegue la tentazione fa seppero onta interviene dei Kaname quei Seixas prova ma che vende i fare
A ai tempietti fine se cioè i da enunciano Cardente ne Piovani ridendo a casa
Ben cioè queste bene afferma ora le sue Alden bene affetto tensione umorismo proprio voi due teschi ex novo exception dei e certi ed è bravo a Peia per cioè istinti media
A ai linguaggi quindi rete Simone e chissà danze approvare detenzione umorismo anche bah
E e fui preso provare Santippo o anche quanto il poi c'è stato il ornate Roccianera tesa a cui guizzi Howard Berman che l'ex senza
E non a ciò prova quelli è scesa ancora in teoria farfalle coccio fax
Qualcuno esce indigeno e onda pranzo dei cioè Now e di sviluppo spendeva per adeguarlo attenti a pois essenza vista Now Agis
Fascismo fa assenze ce Vò esce Enzo Guede Squeri endemici idea qualche esce il pettine no Gmi circa scure dei mecha o arcuate
Salite in sede se spinto Aizen point conversare questo estensori insetti sesto insorgenza
A
E degli deponendo Nardo esigenze e ancora coccio Craxi mai politici dei
E a poco di scena in cui mister al programma di personale ora in sex shop Kamen dei queste stanze ma che ne sai e Carnesi Guasco in provetta innovando e me ne dice ha deciso sbagli bocci senso
Euro l'attenzione
UA essenze Ismaine al fax
A fine lui arredi le cioè per quanto spettasse Minari tristezze safety cioè a stento a deve fare una pazzia il CIPE Ciancio breccia nel merito a cuore coccio fax
X wet medievale eliminare specie Hitch endo bag Giovenzana scene ventenne cioè anzi Janette Tess certezza parlai salterà fuori Darienzo esce bene fenomeni cioè anzi provinciale Adel protagonisti e mite stime Hanzo esserci deponesse dei a by da passa in quel cespuglio se voi sua Van De Falco solo de Scarafile ore sta questi dieci lo scopo debba essere pensavo Ovest a me ne esce da fare presente l'interesse sabato e qui sensuali cui Guido Simona Marasciulo sei sono andato soprasseduto
Guarda che mi aveva roba e cioè no cinque nel coccio fax Nite tenta batte i sei scesa in via UE altri peggiora sta eseguimmo il tuo è il più bravo Manta
Faenza sta
In genere il fuoco riesco cioè s'
Fanno e altri marce Arafat nato il match è acqua cresce la baita no Genna rese ma queste strizza uguale a cento ma questo estensore senese dei yes seguaci ne vende vedo scultrice chiede Desailly cioè agenzie solette di Jesi invieremo a queste went cioè lui José
Anders spavaldo i quali Wylie ieri stenta Merico astratte voi esenti va beh Hennig dei re vero governare pensammo entra alla di cui bis for Finance da oggi UE ma dovesse sprezzo qua senso ex Caravaggio essersi daizee Stearns destra capace
A Saro tenti exemple dette anche batteri pace né oggi di esempi debba ormai l'accensione coerenza a elencare approvare Francia ex se tende
E c'è una Nicola Di Paolo De Censi Genista venti
De Paola Perego del cengia né qua è Hans qua o mise in jeans Duguay fra madre ora che ne so le sue semina con e senza sapeva in fase deve aspetto ed cioè no oggi Welles il sergente Wife ameni aveva viene sempre o altre stime ne Pio Guede mo'acqua il ranger cioè
A
Ai tempi dei pro Hamas Genome ex ai suoi neanche Faenza Guercino Genome questa ces machismo ancora a de sfama stesa salma Chamberlain destinando entra ginseng Geno anzi & esce da un lato est cinetici menhir de Saint Saëns Vegetti Enzo by né né più e cinema indagine Schirinzi curare tende a Jesi in jeans ampi sa ciambella ed ora viene Sant'Anna mentre dei Sammo Arlas calcio torsione
Ringraziamo Iddio fareste Urawa regimi fa ogni ammalato forse eccesso a ce n'era un ex gamba invece che riguarda infame Arex con ESP Veizi Asqeri
Ai fattasi sabato Gin Fancelli
Pisacco nata estese
Uniti ovetti astenia nati in vita né nel Number può essere dei essercene schiene scrisse jeans anziani
Fare dire Mitchell scendendo no anciens Genetics prescienza estensione oppure eccesso Tekken vi è un po'Foresti a c'è aspro Provis oggi Infanti senza Nember estende
Francese geni
E a ok sinergie nome ex mostrava i suoi anche Amnesty UIL cioè rischiano ex Andersen ma è uguale a quattro né attenti subito secchio libraio Bove no Ennio fax in Fake fax Peter segue trovavo ex ciccione anzi coi jeans machismo avrà parlai cioè i corazze indugiano da classe in programmi sarebbe aveva Boy assorbe il mio pensante se si erano in passato solide garanzie vero opzione del sfregi sporgenti Faenza
Saluto dare altri anche squadre un po'Alberto crescente abbatterne nei avesse Gian quasi un carattere seicento esisteva in poi form fame nei
Corre coccio Palazzo due Dejan quasi una sua sua o anche esteri o avrebbe reso Morrissey lui giura il fermo auto ci aveva un tempo Gian quasi sangue dei & del molto bravo fio fax ma questo disprezzo querce mobili ancora intento treni o Sempronio a Genome Exa Vasas quei canali Diana fa essi dopo trovava declinisti sai avanzato se notte Frezza è una Way
A devo Ossona falce sporcare vide di ceci in vendita ottenuto imponenza
E nel noteremo eccetto in Cina come subì ancorché sempre managed mentre tutti vero in viene Spencer Mertens Simone Del Piero in SOGIN expansion Amato Weiss
And Justice degli spazi e cioè no oggi se vende fra otto e c'è il mare garanzie Gino ex precedenti romanzi & però proprie tele appese dei scadenze per produce scambi che però cioè Coccia
Ok suonavano e cioè Ancelotti se muore spesse fichi exemple senza eccessi a sa se cioè Spring però nelle NewCo RAI senza eccessi a tecnici ed esce nuovo approccio fai perché sei censo qua ce ne squali telefonico con Ambrosoli senza quel ruolo genio esce Luciana checks McNair ai prezzi Sex files avveniristiche affluenti
A se cesserà scappa Mexès esatto Mexes il se c'hai sì Whip Dutchman Guerci dei embrione se ne si raggiungono accolte da madre
Penso quale SP da quella emersa cioè sette Hans Meriem Camacho in poi sette stranezze a destra e propri Pratchett
A osso menhir incorpora e riproduzione dove ce n'è ed esperti inespresse fai una in Gesù hanno anziano in quei Frentzen
Teresa case dei NI Anzasca dolcezza in che avanza da s'Mexès Davide attaccò foreste del bravo artista e Xenia Nibali fai per il sesso Zavos il teste dolciumi o o angeli so quando anzi o quei file popolaresco
Poche file prova vale se non sbaglio vergine dei bagni sei scende no by en agli sesso insomma se non coi suoi mezzi Faiza Chen Gest tipo tenevo più più bravo
Sa del programma Saba e cioè nove Geniere esercenti Anec sua Dawa onesti eventualmente Sensi voi artiste come censurare Gene Trieste incauto Corrales
Entro il monaco dis CU
Di fece entrare per il sesso insomma sempre Irene sarò cane valenze presso più qualche maglia larga natalizie Wicar ma questo e non breve tempo cioè se cioè stesa Barrès come sulle sesto in sua ciotola cabaret non me ne a ossa queste Stones S. Cristina Mazza agenti all'offrire se eretti n Huggins può accadere Frova con ex Otis indenne più aerei ma ci può affette voi inadempiente spento Basso Bonito as
A salvo dove Blow
Già spese cane operativo genoma ex baciati da oggi straccio genoma ex a palco Essence diacronica Foundation and e Merico il coccio paste assiste con Ligabue cioè cui resterò
A impieghi tenui search anzi straccio Genova ex traccette quei guizzi Function sul nome sempre Orione questa resa Guerci tenti ambiti Faenza sui cioè Enzo mesce numerici nel curare Erice e nostra uccel nel bene o meno in cemento
A
Quanti due sei all'opera parte eroina show queste in sé cioè sei due
Menare influenzi è spento e ipocrita altrimenti qui en del Pavarotti al niente coi neri quanti tra rete però cenone Xantia e cioè Sanders
La smentita né nel Number padre qua passa Enzo è una guerra semola verso le cinque
A
Suino anche voi seguire hanno i i fai me ne vado spesso i suoi cede casa vezzi Kaname che ancora
N spesse pieghe oggetti sfide canzone scemando esteti Endesa de Saint Saëns Genome questo essere spera di carabina stasera i a Cipriani pone quei essa muore era per assenze cioè sente ad alta energia
Dovrà Otis
Mary e dei suoi suoi esso solvente monade Antonazzo ENEL cedendo luogo spray sanno bene sta quindi rende eesti delle bestie ex può esserci jeans se se Chepe coi restare imponente dischi nome scade ex ehi Gualdo fra otto consenso strumenti Timea poco vecchi mette due tesi estive repressi attese come certe qualità espanda ecco anzi attese come ha UE Cesa ed è dovere duetto ma anche i giornali
A vedevamo umana Function Genomics suo in più c'è chi ancora mense cioè se se inesatta assai come incenso McKinsey stampa UNC Gin Fanci ricambi e due aspetti quei e ne fece mai ateo e senza Meretz cose ah no adesso penso quelle identico fontina un secco anzi qui divertente del provaste Strambini emotive cifra Renzetti resto se CES Genome Sciences qua X Mohamed sani muore sua is
& deve isolare mentre Stienta sarda che nei due assenze senza madre francesi niente Meana in ecco eque deve esserci sequenze se cestino
Passai dover varare affaires de Perotti Ies citerebbe S a
UM avversario è tempo imboccò esca può dire se nei guai stia scrissi consentono a getto in queste però e ER browser nel sangue indossato era fuori Dio NI se CES chiesti S. Amboise
A ex mitezza guarda e disegnano in ragazze stampa vuole volta duale insieme a un sovrana o a se stesso sax lei amore crescenti
Lui solo dannare web teste stanza
A Dezzi quello che aveva lavorato io aveva questi che si era a segna può decani del Sacco e chiese le sequenze Sam voi al fine Ies si spam Defanti prova eri stampavano ai cioè favorire o anche a femm a sì Cuanza anch'dei Sam puoi dire di Raffaello ex verso Chiesa s'neppure omaggio Guibert sapeva erede non Rebecca di Sezze tiento cioè proverò anch'esso un quando Anzani
And deve trovare padre gli sfottò anciens tempo me ne rendessi Predosa incesto e Renna UE che in guerra se cioè si estese move Angelo diuresi avevo fruite in banca
Sto descrivono invece e informare sta fuori fuori dallo auspico così ex essendo Yes dismesso esso esoso per qua pare frane dei delle vespe se cioè si estese qui sì con sfama batteriche rituale vorrei sapere fuori Sexta housing anzi mostri fa un po'angels ma suoi pamphlet
Padre con espanso Bassetti età o sentirsi seguiti spettri EXE ira abietta San by genio eccitarsi nel fare uvaggio legge Oxfam a qualche mago era ben quarto esce lui c'è ancora s'a decade chiave io nei jeans andato il bivacco Anita ho sentiti nati istruendo emessa in voi affreschi in causa nella quale stessa voi Savo
Quel voi produce in vigore spetta il picciolo Djinn cadenze cioè suo visse e morì dare il raìs è nato il finance media quaranta Vittorio Ripa è stato senz'
A cui USA in atti caccia nuova Vespa
Maggiori Elgin Sui tempo Pina un padre tranne essa eesti prova Jack campi voi
Acqua Nissan Presena dosi estesi senza eccessi guaste Expo e sulla scuola immane scuole nei due cioè checché se ne dica e scendere eccedere i testi già stamane informare ci ineffabile Function dall'esigenza
Solo cui trama approvare Ginza panna un fa un cenno
I due Hobbit da ottenere permette insorge incerta annui spetta sibi ebreo a bombardare
E il Protti causa nel fare commenti Anders colpi Guiso estremi pari Guetti domani che processa meno aveste CEPS con essa quei dieci sedute lotte Gino Expo esce in sé eccesso
Saronno guasto verandone tratta va be'a
Nato il paginette siete calcetto il malato anni haitiana perché esce mentre Enzo mecenate Settis c'è steso varie spese stanze scienza senz'acqua quelle fragile peccio Immacolata tiene questi cacofonia quel personale
Andare a qualcosa cioè ex sei Enea
A
Se cioè se c'è stesa vai avesse suonato e morsettiera paurosi SISAS eccesso ottanta
E Chepe quei de me de che scavalca come squat coppette qua in questo io mangio scusate danzavano su questa vennero infette due testi lascia o i delle grappette a tutto il Ponente
A difesa ero io foro due affrontò microcassette by the Sea tensione segni cioè esente mania dell'esperienza dai nuovi sapori
A da grazie Sabino Pavon questa cioè che un regista pari del rosso Adelmo Sbk consulte sbagliasse ed Zare Cai situazioni appartenenza o premiati andare a casa che
A falsa sedere stemmi che rende Pera fonti decide di Genova è il suo ingaggio Buarque regna nel Po ne so vinse cinque disprezza est Andes sex sui suoi Galles del regista
No vanta una rete del sesso invece lo approvo me Scame sfonda Brown sette sette due ci sapeva che specie vecchio fede sballo del Sesia emersa Nava in fuori a Mexès famoso Witte offre Bailén cacofonia
Solo prove inseguì sensazioni coi ci farebbe Prospera registri meno incide spessissimo Nwankwor qua nel suo sesto su cui nato dette alle sei Damone queste stesse geni and Tanzariello esco Cesa sempre si va avanti
Pezze nato il ex queste nella decina esperienza cioè Calcara borse eccesso a
Quindi certe esigenze per quei by checché ne attesta ginepraio comunque arte garantiva blitz sta pezzi ventisette duetto violence andarlo a Kfar Desperado vario e sento dati
C'è assicura so adesso sapeva viscontea squilla problema se vuole fare una Spampani invano e senza dover a Chairs Ceci solo pomeriggi in duetterà risparmi Affairs quel Pd
E avere nei suoi spazi hanno
Quindi quindi no un attimo ma c'è batta Fanci ad Egina ex attere Moscova è quella emersa ossa Omo documenti detesto by ove si svolge epopea potete ancora quassù o altro se Fester ci avete preso estensioni
A Wirth cioè che ne prese shock sono in acqua dolce investito in sede stesso farebbe ne disegna porvi mano qua spezzina stessero rettili ai Diana file sfuggente Nessenzia near senza piogge nome Knowledge
A questa Reba innata infine tra e quindi riescono a Susan Boyle Investimenti commosso Boateng Beppo ai Paesi a tenne sì consegnai
Cancello genio esci ne aveva smesso da sola ma questo testo non è sequenze information e dieci nome appende fra per fine svolti fece la degente
Tende tecnici tracce cioè insomma esce la Nawal Aquila restando a fare uno stage che si era del fine cioè teniamo assessore cioè Geana ex per diciamo in spray siti de
A avrebbe Genova in Catch me a queste istanze fai testi for Pacini fai sit-in dei a testimone mai by
De saremmo acquisire
Cioè non è nuovo moglie cioè o chi era bare CSR Morgan
Vigente
Soldati francesi ampi Gué sventa
Detto anche fuori provvede un a fine mandato qualche scende
Lui
Però sembra qua e vorrei se femme esso adesso c'è la spinta non solo attende Sui gente qui tende a fare dello prova essi chi invece lo bare quindi ai piedi vigente testa antenna o assicura campane facessero qui a grana fine quadrimestre perché come fa a medicine Venza e ti svela rispetto ai se sono ancora no ma sono manzo deve sempre peggio pure Area comma sono meno due C desse esatto boh queste spalle famosa un boss sarto botte sporco e so close restanti
Entrambi su quel divorare femm ad atti in entrata da pane Cosimo il sesto Enzo del fuori dei siti di Janet invece da Hogwarts dove cammina esce se da dei dei qui Genoveffa in India dei l'ok su una degente a cui Saguatti infuoca qua non spende Sui gente poco si consegni anzi questa vigente
Adesso si è proceduto bene How I scrisse Genome Xiyuan senza eccessi a di Wako anzi era il decreto chiedevo Americà s Schifano anciens a o dei di guinzaglio imbolsito una sua poi jeans research e Petroni e in via Savona no alcune tesi sul sesto insorgenza questo è ugualmente Hennessy veggente Mary risata Westerwelle in combutta ora Vespa varie stranezze cioè sposo Bova on anzi Gucci
Ossa ordinato attribuite
A dei
Soiano uguale c'è in gioco jeans lei dice oggi Enzo Paola due bit inserirlo ai proprio Biava richiede sporche Desy spese estense Gene nel scherza
Abate qualora Giambattista Reitano française che povera quanto lui
Tenta di però con se Cuanza Sanza imposti consiglio che Marco Nese quei suoi pregi in acciaio
Fuori del fondo Cova e stessi tipi gentil sciopero dire portare a fare infetti godesse Enzo Anna richieste Number Hakkinen nelle agenzie danze uguale cui sono esame nel cibo un ampio
Se lo augura venne in piedi vero che essa produce Stitch anche cestistica degenza quando essi consente all'assenza tenendomi sesto in danze sarto Boccafossa non se ne sia vincente Ocean San Renzo Capra affannare nere
Expo che nell'Expo esce in carenza va fanerogame io approcci Sven Fesf Meshal dei sentire il bluff André dei retaggi trasforma ore guineana Finance Guede OSCE sue molte degenze
Qui siamo e offre Nesci erede navale ai approcci Toquinho improvvisato se cioè Anjou Cerese queste stanze gente
Fra enti Misani a eccesso festa
Guetti delle schede senza
Salire settanta sanarli Sequence Twiggy anzi durante i a uno anno qualche suonatore disse desiste sesto insorgenza Enfants arresto equestre di Anderson esso deve essere stanze gente e lui avrebbe free quel cessate dopo
Sto deve avere se se cioè senso dei a vicenza poi Cilea ed è una conseguenza solare a San cioè ma anche lui Gian espressione svenduto o dove fare la ragazza dei a un mancino reggente quindi a fare ciò che non si consuma oggi a no ed è assai frequente Fanzago e senza eccessi
Penso ad Arcore scapolo chiarezza c'è un
Che era alti dei
Gino Service de voi sareste alleanze sei otto punti spesi s'
Saluto perché agli quali rinnovare deplora il Jensen Gina un stipendiato di spessi Sussex Riccardo
A a Cares che provvede Just menziona cioè insomma esce inspirare ci sperano i Chappe Cowan Stem Cell manzo ora in atti a valere due è il vecchio Hampton Asm sganciamento ASMEZ Curtiss Jenny senta
Via indagine spron morissi consensi qui già nei Shields che era in coerenza da
Ceste in Fragasso expansion satanico accetta infatti e poi ha senso indecenze scienza sanguinante quale Number cioè anziane quantità stabilisca Enzo dal processo adesso qualche ma guardate Marco Causi guarda espresso venti Genziana tetti Enzo del
Qui c'è l'umorismo anche CEO sanno avveniristico Enzo nave neonati a volere il saluto
UEO propendere né Next Pio Manzù uiguro entrati evoluzione a grana fine due ceppi schiera degenze sue spacco fuori siti dev'essere Stones bene a Barra sexies avvenire Faggetti
A canali pezzo da e qui armati Berge nome questo Essence hotel scuri calma ci può acque
Ho eran già Spagna insegna firmò lampade traduce i soci mare a fare attuale fine cioè ex quindi palco essa Jeseník avere Senato o ANIAI The Simon sprone agenzie a voi a me ne mostra il fuori approccio alberi estranei ai fatti
E di sapesse Expo esce dall'altra l'igiene nei centri Ana eccome Baray andate
Erede Vespucci spostavo infetti fax estivo express dei paninari finanza ONU in eccedenza già neppure questa soglia per cui attenzione decenza Gene corrisponde un regista ed estendendo cioè anzi mere Simon se in seno ci ride Simon & Simon sanno anzi agenzie ne sai quotate sono in piazza Deng eccetto i duecento tiene a
Della debba Ogana nemico Mason sesto ansie o autisti mentre Jesse Fossett urgenza and Finance vada odierna mette in che mani Way se ne venne Genova campo ex Est in guazzetto interi a Farnese dovrò pensare stesse tecniche Reggiana s'sono dove si trovava male perché esce da bendaggi ne espone jeans
A del resto qua tante però baraccone vai avesse un senso Gino expansion vecchio di sette intestinale
A Nathan gestendo in a da delle spiagge un aspetto a cui Bossi Annan dovrebbe fare varie sospende tra Otto e mezzo expansion trattenessero weekend Wenner senza pure prova in Sant'cioè insomma esce nastri ormai
Poi ci può a
Ed era farà ESP che esce oggi in Francia e ne so so qua quanto è bravo ma nemmeno tenga fede fan Cialis fan già tenente come spetti Aggiano e cita fonti decido qua e anzi e mette invece anzi quando fase mezzi per Cézanne NATO e UE di Arexpo action
Vero esigenza in come Ceci
Ah va schietta è un gesto e anche a questo
Ma è questa Terranova verso est Genome sicuro propagasse due no cenavo don eccessivi a Genome che entra ma esce inviterei guai Michea dei miei
Research temere rese una quest'Nazario vendere tout-court Minoretti che entro fine chiavi ebbene eccessi
Saggi nome questa idea risorse mai della perché esce Archimede jeans fare c'è no agenda Odette Strauss Andenna estera qualche ECM
A Henze ormai
Desse sempre Hornets Veggiano ai fra mostre vaste Just perché esce lui estivi espandendo a salvare fruizione a distanza essa spopolare seleziona Beckham monolite Falco C due
Can dance colleghi di del romanzo il Canada organizza i sionisti di aver stoppando impiantini ed espressione
A offendere stanchi
Ventisei marzo se aveste mio marines presentation a Bette inquadramenti proprio quei il casato pasta esponente sto a nei due punti Juve Cesca otto anche il Peck a spasso industria qui Thuram spicca
Rifiutata ventitré maggio luogo ospite del suo stemmi coerente scarso un sessuomane
Totti perché qui ci sono un po'di emergenze prima di tutto sessioni parallele
E poi siamo in un ritardo abissale quindi io mi scuso da subito ma chiedo a tutti di speaker di stare al di sotto dei tempi previsti se possibile
E poi anche sulla discussione penso che si possa fare chi la mente poi fare una discussione anche più individualizzata se no non ce la facciamo
Le i tempi che sono state assegnate dall'organizzatrice scientifica logistica tutto del convegno dalla professoressa Giuffrida sarebbero stati di mezz'ora per la prima presentazione
Comitato scientifico di cui non faccio parte
Tutti bravi
E ma infatti ci funzione
Va be'se posso ricominciare volevo dire che la prima dovrebbe la la la dottoressa Santina Bruzzone del nostro gruppo a Genova dovrebbe parlare per mezz'ora ma rapidamente se veramente decurtata
E le altre comunicazioni selezionate dai poster avrebbe un tempo comprensivo della discussione di quindici minuti quindi fate vobis non so cosa dire
Le prime tre relazione di questa di questa sessione hanno a che fare con cellule staminali e già abbiamo avuto un ricco e ghiotto antipasto con la dottoressa Azzolina che ha fatto veramente molto bene ha presentato dei dati l'estremo interesse in quanto molecola Rizzati cosa che spesso viene ignorata quando si parla di cellule staminali
E le un aspetto importante è quello dell'espansione delle cellule staminali e anche della selezione alle prime due relazionano a che fare con questo interessante aspetto
Quindi dare decisamente la parola alla dottoressa Santina Bruzzone che lavora a Genova alla sezione di biochimica del Dipartimento di medicina sperimentale che parla di problemi di espansione di cellule staminali emopoietiche umane
Espansione invito è in vivo mediati da una nuova molecola segnale di a Lippi riposo ciclico
Ciampino veloci
Allora presentiamo innanzitutto i protagonisti di questo studio che sono DP riposo ciclico
Il CD trentotto Viesti uno e precursore emopoietiche ci l'ATP riposa ciclico è un mobili già attore di calcio universale da Astor sempre cellulare chiama Dina sensibili
Recentemente è stato dimostrato che è in grado di attraversare la plasma membrane dicendo le intatta Traverso inclusivi trasportatore ritenuti lesivi a meccanismo si equilibrati vivo che concentra attivo
E la di più di poter ciclica coinvolto nella regolazione di numerosi processi cellulari calcio mediati
Ed è sintetizzato a partire da Linate da enzimi all'attività di così a di Pd politici plastica nei mammiferi dal duetto Intini Ricci di trentotto di Asti uno e da una disperati solubile non ancora identificata
Perché hanno confronto CD trentotto ebbe Asti uno CD trentotto nemico proteina transmembrana che si organizza in strutture time ricchezze tra Americhe e permette il trasporto intracellulare menta meccanismo concentrati di Patricia di Piave Viesti uno invece è una proteina ancorata tramite gli così del fosfati dell'inositolo era probabilmente incompetente per il trasporto del cioè di piante
CD trentotto e Viesti uno sono estrassi nel micro ambiente midollare anche se su tipi cellulari diversi CD trentotto Espresso su a bassi livelli
Sui precursori ma poi etici maturi e ad alti livelli sui linfociti
Chiesti uno invece Espresso sulle cellule mesenchimali dello strano emopoietico per quanto riguarda la loro attività di tipo dirci Clásica l'attività specifica Ricci di trentotto e alta rispetto a quella di via Asti uno che molto bassa
In mancanza di marcatori specifici se non tipici precursore Remo politici vengono identificati attraverso saggi funzionali in vitro ed in vivo
Si definiscono cellule staminali emopoietiche a quelle che sono in grado di ripopolare una scritta irradiato
I precursori mo'politici più immaturi vengono definiti long term calciare inseriti in Sant'e sono quelle cellule che sono in grado di sviluppare colonie dopo cinque settimane di cultura su uno stroma in assenza di fattori di crescita giunti i precursori emopoietiche ci più maturi vengono definiti cosa ogni forma un salto e sono quelli che sviluppano colonie in presenza di fattori di crescita dopo due settimane
E in il numero di colonie viene valutato dopo due settimane di cultura insiemi solida per cui per quanto riguarda le anti sia essi
Il numero di colonie viene contatto dopo cinque settimane di cultura liquida più due settimane di cultura insegni solida non è anch'io era chiara se le cellule staminali emopoietiche gli enti se essi siano due popolazioni in realtà distinte o no
Il progenitore Remo politici crescono in contatto con lo Strama formato da fibroblasti osteoblasti le cellule mesenchimali che sono costitutivamente Viesti uno positive
Studi precedenti effettuati nel nostro laboratorio in collaborazione con il gruppo di Ematologia dell'ospedale San Martino di Genova
Hanno dimostrato il ruolo di Cia di Piario e come una citochine mo'politica questi studi utilizzavano come materiale di partenza le cellule mondano create purificate da sangue di cordone ombelicale
La preoccupazione di queste cellule per ventiquattro ore Concia DPR a concentrazioni entro molari era in grado di stimolare il numero di ce la feci la dimensione delle colonie formate e di aumentare l'esigenza di piastra Tura infatti le celle pre incubate concia di Piave arrivavano a generare colonie fino alla quarta generazione rispetto alle cellule controllo che non andavano oltre la seconda generazione
Il pretrattamento concia di pigliare determina anche un aumento delle altri sensi e delle precorrere delle staminali e un'espansione delle staminali finito recipienti per cui il Ciadi pigliare ha estratto sia sui precursori più maturi che su quelli più immaturi un effetto simile del Ciadi pigliare si aveva sulla linea si ritrova i vecchi mieloide
E l'effetto non era mediata da Cellule accessorie
Abbiamo descritto il meccanismo di azione del Che DPR in seguito all'influsso del Ciadi tiare mi precursore diamo poliedrici probabilmente possibilmente tramite i trasportatori dei nucleosidi com'era stato descritto in altri tipi cellulari
Sì a un lento aumento della concentrazione intracellulare di calcio
In questo momento era inibito dall'utilizzo di antagonisti del Ciadi pr
La Giunta di antagonisti del del Ciadi pianure
Di provoca una diminuzione della concentrazione basale intracellulare di calcio è una inibizione della crescita di colonie per cui ciò DPR in da Oggiono potrebbe controllare la fuoriuscita di calcio dal reticolo endoplasmatico
Controllare i livelli basali di calcio
E il tipici fra cellulare dei progenitori ricamo politici
In questo studio ci siamo chiesti se lo stroma emopoietico contribuisce a una produzione edilizia DPR nel micro ambiente midollare
Per questo abbiamo sviluppato duelli in estro mali delle linee stromale C di trentotto positive Viesti una positiva in grado di generare cha DPR extracellulare a concentrazioni in anno molari
Questo avviene grazie alla fuoriuscita di Nad dai i canali dico a Messina quarantatré abbiamo dimostrato sono competenti per il rilascio di Nad
Secondo un meccanismo passivo quindi secondo gradiente
In seguito abbiamo valutato gli affetti di una con cultura dei precursori emopoiesi PC sopra questi strani da nuovi ingegneri infatti
La transazione abbiamo tre assetato alle Cellule tratti tra con C di trentotto umano con Viesti uno Murino tramite selezione al fax abbiamo isolato due popolazioni dicendo le cose a diversi livelli di espressione di Viesti uno
E abbiamo poi caratterizzato interscambio chimicamente queste linee estro mali valutando l'attività ci plastica il contenuto intracellulare trinate dice DPR e di calcio
In seguito poi alla con cultura delle celle mono nucleare sopra questi Stramaccioni Rizzati abbiamo valutato la crescita delle colonie in vitro e l'attecchimento in vivo
Vediamo la caratterizzazione medio chimica delle linee stroma Ali preparate l'espressione dice di trentotto nelle cellule tratti tra
è accompagnata da alti livelli di attività di pini politici plastica a cui fa seguito un notevole innalzamento della concentrazione intracellulare dice ripigliare che modifica il calcio basale della cella stessa
L'espressione invece di via Asti una compagna Ferrara limitata espressione dell'attività ci classica in accordo con la diversa attività specifica dei due intimi e illimitato aumento
Della concentrazione intracellulare di calcio non modifica al calcio intracellulare nella cellula stessa
Per quanto riguarda le cellule costi tra i diversi livelli di espressioni
Di Viesti uno sono accompagnati da di darsi livelli di espressione di attività ci pratica e di contenuto dice DPR ma il calcio basale intercellulare non viene alterato
è importante rilevare che l'attività extra ci traghetta misurata nelle celle di osti uno positive sia le cose che le tratti tra a valori simili a quelli che sono costitutivamente espressi dalle cellule mesenchimali umane
Che sono parte Gasti uno positive
Quindi abbiamo coltivato le celle mondano create che sono quelle che contengono i precursori emopoietiche ci sopra nostre cellule tratti tra tra settanta e combina Steve uno o CD trentotto abbiamo in questo caso il porto
Il totale delle colonie ottenute dopo una due tra o quattro settimane dico cultura come si vede la capacità furono genica è significativamente aumentata
Nelle celle mondano creata e che sono state coltivate sopra un Fever di Asti uno positivo rispetta i controlli già a partire dalla seconda settimana
Al contrario la con cultura sopra uno fidarci di trentotto positivo inibisce fortemente la produzione di colonie già a partire dalla prima settimana
I risultati di altri esperimenti condotti con lo Strama CD trentotto positiva ci hanno permesso di concludere che i livelli di espressione di CD trentotto determinano gli affetti di una cultura e lungo termine e quindi di cinque settimane
Sopra sul determina gli stati sul numero di colonie che poi si sviluppano
E ad alti livelli di espressione di CD trentotto fa seguito un'inibizione della crescita di Colonia mentre a bassi livelli di espressione segue una stimolazione nel numero di colonie
Una breve con cultura di Sole ventiquattro Ore soprano Stramaccioni trentotto più stimola la cui la crescita di Cologno a lungo termine quindi vorrei far cui notare che queste cellule hanno visto il CD trentotto per ventiquattro ore
Hanno poi fatto una cultura per altre cinque settimane in in su uno stroma C trentotto negative e la crescita di Cologno è stata valutata dopo altre due settimane solo ventiquattro ore con uno stroma generando Cia di piazza
E questo gli affetti che abbiamo visto prima inibitori della crescita di culture su una cultura a lungo termine per cinque settimane il soprano Stramaccioni trentotto positivo
Possono essere dovuti ad un rilascio di citochine inibitoria da questo tipo cellulare
Un analogo esperimento dico cultura Anniciello temo non create è stato condotto con le celle colse e come si vede la capacità delle cioè delle corse di supportare una crescita di Cologno a lungo termine è dipendente dai livelli di espressione di Viesti uno
Dopo cinque settimane dico cultura asso sia ha avuto uno sviluppo di colonie solo sulle cellule
Nelle celle coltivate con uno stroma con lo stroma esprimendo ai più alti livelli di Viesti uno
In un'altra tipologia di esperimento abbiamo invece purificato le cellule CD trentaquattro più che sono la popolazione contenente più accuseremmo poi il PC
E l'abbiamo Coco e attivate per ventiquattro ore soprano stroma CD trentotto positivo
Come si vede
Se ha abbiamo ottenuto un circa raddoppiato il numero di colonie in seguito ad un all'innalzamento della concentrazione Pazzali intracellulare delle cellule CD trentaquattro più questo risultato innanzitutto conferma
Il fatto che ciò DPR sette sulle cellule CD trentaquattro più senza necessita di cellule accessorie
Il dito Ida Morello e l'MB Jannetty arresti sono due molecole che inibiscono i trasportatori dei nucleosidi che noi abbiamo dimostrato oltre trasportare il nucleo esiti quali adenosina Guidina sono anche in grado di traslocare il Ciadi pr
A seconda della concentrazione a cui questi inibitori vengono utilizzati inibiscono i trasportatori del nucleo esiti a meccanismo o equilibrati Ivo concentrati
A in questo caso noi abbiamo aggiunto il differita mollo e la nebbia nel pr che ha riportato in figura risultato
A concentrazioni nano molari e abbiamo un come si vede è inibito le fette della cultura
Sulle sviluppo di Cologne e sul sull'incremento della concentrazione basale di calcio delle cellule CD trentaquattro più per cui questo risultato indica per il Ciadi Piario e prodotto dallo stroma
Viene e entra nelle precursore Remo politici attraverso trasportatori templi CT a meccanismo concentra Chivu
Vediamo i risultati ottenuti in vivo in un primo protocollo è stato valutato l'attecchimento
Mi topina skipper delle cellule mono annucleate che sono stati coltivate per ventiquattro ore sopra uno stroma CD trentotto negativo CD trentotto più e come risultato abbiamo ottenuto che dopo sessanta giorni dal trapianto il numero totale delle cellule umane il CD trentaquattro ci di quarantacinque positive e il numero
Diciannove le mie laidi mature lecci di trentatré positive era incrementata di tre volte negli gli animali che erano stati
Che erano stati infusi con nelle celle lepre incubate sopra uno stroma CD trentotto positivo rispetto ai controlli
Nel secondo protocollo abbiamo invece simultaneamente con infuso le cellule Monocle attenti con lo stile Cellule dello stroma o CD trentotto negativo CD trentotto positive
E in tabella riportato il risultato del fattore di espansione delle cellule CD trentaquattro più che come si vede a tre volte circa più alto negli animali che sono stati con infusi con un lo stroma in grado di produrre cioè di piante
Questo è uno schema riassuntivo dei dati presentati finire cioè all'estero mali CD trentotto positive o Viesti uno positive sono in grado di generare
Cioè ripianare nell'ambiente extracellulare che viene internalizzato dei precursori hanno poi il PC attraversa un trasportatore concentrati Iva dei nucleotidi
Il sa di piano intracellulare modifica
Mi dispiace questa doveva essere
Una freccia
In su
Un aumento allora aumenta la concentrazione basale di calcio e la propria la velocità di proliferazione delle dei precursori emopoietiche sì
Nell'assai le Stra manici di trentotto positive il Licia DPR intracellulare che modifica la concentrazione innalzando era la concentrazione in basale di calcio provoca il rilascio di citochine che hanno un effetto inibitoria sulla proliferazione dei precursori Remo politici
Allora dagli esperimenti in vitro le conclusioni che possiamo trarre sono fece DPR prodotto dallo Strama concentrazioni nano molari
è in grado di stimolare la proliferazione del percorso eremo politici agendo sia sui precursori più maturi che su quelli più immaturi agisce direttamente sulle cellule CD trentaquattro più e in tre anni percorso emopoietiche Attraverso un trasportatore Veno presidia meccanismo concentra tipo e modifica la concentrazione intercellulare di calcio inseriti arrendi N prodotto a concentrazioni
Le modalità ottimali dagli stroma Viesti uno positivi
Invece la conclusione che possiamo trarre in vitro la più interessante è che l'Est la simultanea con infusione delle degli precursori emopoietiche ci con uno Strama CD trentotto più che genera cioè di piante
Aumenta migliora l'attecchimento delle cellule staminali a lungo termine
E vorrei solo sottolineare ancora che questo stroma CD trentotto positivo quando viene con infuso viene
Di lui top per cui la concentrazione dice DPR che in realtà viene prodotta e sicuramente a livelli nano modaiola subiranno Mulan
Grazie Santin anche per celerità c'è tempo per vivere due domande se ci sono
Ma non voglio essere diciamo buttarle quindi impedirlo e quindi se ci sono medici
Momento che mi limito
E gli esperimenti in vivo le cellule stromale CD trentotto positive scusa non sono qualità è negli esperimenti in vivo De Cello leciti stromale incide trentotto positive
E in oculate dove si vanno a nozze si vanno a localizzare deve quindi Villoresi ambientali sì sì per una percentuale circa il sette per cento affatto vanno a localizzarsi nella troverò ma ora si e fate dei condizionamenti specifici perché nella mia esperienza bisogna ab
Per ripulire per è competitiva il ripopolamento al ribelle stromale nell'almeno nel topo
Per cui se si può allora mette Chimento sì e tv bisogna andare parecchio su condizionamento in genere Colli e direzione
Non glielo so dire ho dimenticato tra l'altro di ringraziare di citare il gruppo degli ematologi io per quanto ne so io non facevano dei prezzi per i condizionamenti appunto alle percentuali di attecchimento che ottenevano erano quelle
Altre domande alimenti
Bene se non ci sono grazie possiamo passare al secondo che diciamo molto interessante perché utilizza un tocco particolarmente intelligente per selezionare cellule staminali emopoietiche agendo sul recettore del del eritropoietina nel nell'azione del presentato dall'ex grande
Del gruppo di moderna del gruppo di Fulvio barbiglio Sergio Ferrari appunto ditta anche qui della concessione grazie
Ok
Dunque la terapia genica delle malattie genetiche ematologiche e almeno dal punto di vista teorico una procedura abbastanza semplice e consiste nel prelevare le cellule staminali ematopoietiche dal paziente
Tradurre in vitro con vettori virali allo scopo di correggere il difetto genetico successivamente in oculare al paziente per ottenere un effetto terapeutico
Fortunatamente uno dei importanti problemi che si presentano quando si fa questo tipo di terapia è rappresentato dallo scarso numero di cellule tradotte quindi geneticamente modificate e si riescono ad ottenere
Questo problema può essere teoricamente risolto oltre sistemi tipo quello c'ha parlato la nostra collega in precedenza attraverso i cosiddetti marcatori di selezioni in vivo che sono sistemi di selezioni in grado di indurre un vantaggio selettivo in vivo
Fra questi sistemi possiamo certamente citare igieniche conferiscono la resistenza a farmaci la cui efficacia è stata ampiamente dimostrata ma che però hanno il limite dell'elevata tossicità dei farmaci che sono necessari per ottenere la selezione per questa ragione
Alcuni propongono di utilizzare come alternativa recettori modificati per fattori di crescita
Esattamente basandoci su questa premessa che non stiamo investigando la possibilità di utilizzare Juan marcatore di selezione in vivo
Una forma troncata del recettore per l'eritropoietina che manca della sua porzioni caro Bossi terrà Minale e che viene normalmente denominata TIR può R.
Questa possibilità questa ipotesi è supportata sostanzialmente da tre evidenze sperimentali innanzitutto Tiepolo R. presente Hoop così espressa intona se insicura sensibilità Perrella litigando per l'eritropoietina
Che è superiore se paragonata a quella del recettore Guaitamacchi quindi fu lenta
In secondo luogo cellule staminali ematopoietiche che esprimono che può R per via transgenica presentano un vantaggio selettivo in vivo se trapiantate in topi normali che sono successivamente trattati con eritropoietina
E infine mutazioni analoghe del recettore per l'eritropoietina sono state osservate anche nell'uomo dove danno luogo a una forma
Di eritrocitosi benigna familiare di cui non si è mai osservato una trasformazione in senso non plastico il che fa pensare che questo marcatore di selezione dovrebbe essere privo di potenziale oncogeni e quindi abbastanza sicuro per un'applicazione in terapia genica
è stato dimostrato che queste proprietà biologiche del recettore troncato delle riscontro poche Tina dipendono dalla presenza di un dominio di regolazione negativa che si troverebbe all'interno della porzione dell'ETA
Che che se ci darebbe la sua funzioni grazie alla presenza di siti di interazione con la fosfatasi essi H P uno e la proteina Sox tre cioè proteine che inibiscono la trasduzione del segnale di membrana indotta dall'eritropoietina
Ora quindi gli scopi nastri cerca sono di valutare se ti ho guerre conferisce un vantaggio selettivo in vivo a cellule staminali ematopoietiche anche quando tradotto mediante lettori Pietro vitali e in secondo luogo valutare gli effetti biologici indotti da diversi livelli di espressioni tipo R quindi in altri termini effettuare uno studio di trance oggi indossa i jeans
Ora per funzionare correttamente ci questo sistema diciamo per funzioni correttamente ci si aspetta che si inattiva basse concentrazioni di rito positive che venne invece attivato delle varie concentrazioni di eritropoietina come quelle che si riscontra durante uno Stato nemico o in seguito al trattamento farmacologico con eritropoietina dando luogo in quest'ultimo caso l'espansione delle cellule staminali ematopoietiche tradotte che qui sono rappresentate
Il rosso
è chiaro che perché questo avvenga correttamente l'espressione del recettore sulla superficie delle cellule tradotte rappresenta un fattore cruciale dal momento che una scarsa espressione potrebbe portare uno scarso effetto pratico è un'elevata
Espressione al contrario un'attivazione costitutiva della patto di trasduzione del segnale l'eritropoietina
Ora per tutte queste ragioni e poiché noto che il l'espressione del transgene influenzata dalla posizione che gli viene assegnata all'interno del vettore virale abbiamo sviluppato una serie di vettori retrovirale quindi sono rappresentati tre
Tutti questi vettori virali come potete notare esprimono che può R piange fra Sector
è stato utilizzato come genere porte poiché essendo marcatori superficie consente di monitorare infezione delle sole bersaglio l'espressione del vettore attraverso una semplice analisi cito fuori medica e questi due geni sono diciamo contenute all'interno di questi vettori in diverse configurazioni in particolare
Vorrei richiamare Aosta attenzione sul prima e sul ultimo vettore in questa diapositiva si tratta di due vettori bici Strong ICI
Che esprimono un trascritto appunto bici Straw Nico guidato da letti arbitrale all'interno del quale tipo R si trova in un caso a valle della sequenza emessa e nell'altro a monte della sequenza era essa avesse sta per Internal Rimbaud soma lente saette si tratti una sequenza che consente la traduzione di un cd neanche si trova a valle di un altro ci tiene a all'interno dello stesso trascritto
Questa il nodo che questa diversa configurazione solitamente influenza l'efficienza della traduzione questo poi terzo vettore semplicemente una diciamo deriva dal dall'ultimo lettore rappresentano diapositiva per sostituzione della sequenza adesso con un promotore virale interno SV quaranta e che di regola dovrebbe risultare in una interferenza trascrizionale con la unità trascrizionale ammonta
Questi lettori sono stati utilizzati al miliziano inizialmente per infettare
La linea murina mieloide trentadue dicano all'Inter Lucchina tre dipendente per valutare l'espressione del recettore troncato la sua influenza sull'attività proliferativa differenziati ma di queste cellule
Nelle nostre condizioni sperimentali normalmente otteniamo
Incastrato il pulsantino
Otteniamo una efficiente traduzione del dieci venti per cento sempre fare il pulsante
Nelle cellule trentadue di ma quello che più importante
Di seguito osserviamo che questa percentuale di espressione in certe setto rimane costante nel tempo se le cellule
Vengono coltivati in presenza di interloquire tre mentre aumentano salgono fino al novantotto novantanove per cento sulle cioè lo rendono coltivati in presenza del tuo politica e che significa che le cioè l'ho tentato di tradotte vengono rapidamente efficientemente selezionate dall'eritropoietina
Queste cellule inoltre acquisiscono come atteso la capacità di crescere con modalità eritropoietina dipendenti mendace ricontrollo non tradotte
Non acquisiscono questa capacità
è chiaro che questi dati rappresentano indicazioni che Restore troncato perito politica Espresso che attivamente e funzionalmente attivo in queste cellule tuttavia per fornire una però diretta di questo abbiamo seguito dei saggi di bagni in con eritropoietina radio di Nate risultati lo scaccia sport riportati in questa tabella ci dicono perché può R spesso in tutte le cellule trentadue di tradotte
è come atteso l'espressione che variegata
Nonostante questo dato risposta proliferativa la stima se ne con esito questi ne è risultata sovrapponibile
Nelle trentadue di tradotte con i vari vettori l'attività politica che è stata misurata attraverso analisi cito Forin etica in seguito eseguita dopo colorazione con proprio duro
E il differenziamento grano citare indotto dal Cissé sette delle cellule trentadue di tradotte risultato sostanzialmente mantenuto in tutte le popolazioni cellulari
Esaminate nel differenziamento è stato monitorata presso l'antigene del marcato differenziati comma uno
Ora l'ultimo mi diciamo tutti esperimento che potevamo fare per valutare l'attività biologico questo recettori consisteva in una sorta di sala gioco di competizione
Invito questo saggio è stato eseguito di Lou indole trentadue di tradotte uno a cinque con cellule non tradotte poi coltivando l'in presenza di concentrazioni satura anti di eritropoietina e di interloquire tre quello che abbiamo visto
Consiste nell'osservazione che la percentuale di viceprefetto rammenta progressivamente fino a raggiungere praticamente il cento per cento nell'arco di circa tre settima di coltura con tutti e tre i vettori utilizzati
Ora è chiaro che questi dati necessitano di essere verificati in vivo per poter sostenere che che può R. può fungere da mattatore sezioni in vivo e per questa ragione abbiamo utilizzato un modello Muti Murino di trapianto sin genico di midollo osseo
Del nostro schema sperimentale le cellule midollari di un topo donatore vengono prelevate tradotte con super metà antivirale in presenza di citochine poi oculate in un topo che è stato il radiatore talmente
Il vantaggio l'entità e vantaggio selettivo viene poi esaminata confrontando la percentuale di espressione di
In jet setter quindi genere porte e promossa dal vettore analizzato e confrontandola con quella di un vettore di controllo che contiene soltanto il genere Porter qui naturalmente i topi vengono sottoposti o meno a trattamento con eritropoietina
Ora per avere un'idea di quale fosse la
L'entità di espressione di che può R. sulla superficie di cellule primarie quindi dice lo che fossero in qualche modo rappresentative delle matto policy normale abbiamo seguito un'analisi di bagni e quindi di Scaccia lotta sulle cellule
Midollari del donatore tradotte con i tre vettori rétro virali e quello che abbiamo visto consiste nel fatto che quando ti e può R. posizionato a valle della sanità del vettore
La densità recettoriale osservata che attorno a circa mille recettori per cellula è sovrapponibile alla all'espressione del recettore quel type nei precursori ritrovi di normali
Al contrario quando ti e può R. si trova a monte della sequenza eresse all'interno di un vettore bici stranito
Che poi Rover espresse si assiste al momento l'espressione circa quindici volte il terzo vettore fornisce sostanzialmente una espressione intermedia
Per questa ragione il primo trapianto è stato eseguito con il vettore che promuoveva diciamo livelli fisiologici di recettore troncato
Unitamente
A un vettore di controllo insomma che come ho già spiegato presentava soltanto il genere porta quello che abbiamo visto
Dice che nonostante le cellule Mina del donatore sono tradotte a efficienze paragonabili
Topi trapiantati
Topi popolati con cellule di donatore Trust dotte Conte può R. presentano una un vantaggio selettivo quindi un aumento della percentuale di incerta Sector che otto volte superiore a quella dei topi di controllo questa percentuale è tuttavia inferiore ecco questo diciamo l'abbiamo osservato a livello del midollo osseo questa percentuale tuttavia inferiore a livello degli organi fornice della milza e del timo questo vantaggio selettivo peraltro si instaura apparentemente
O meglio non aumenta dopo trattamento si stava indipendentemente a trattamento con il logo Edina non aumenta dopo trattamento con eritropoietina eseguito in questo e spero meno esperimento subito dopo
Il trapianto e quindi durante la ricostruzione Mato politica questo comunque non è un dato particolarmente sorprendente perché l'aumento potrebbe derivare dal o meglio vantaggio selettivo potrebbe derivare dall'aumento del livello endogeni di rito poi Tina che consegue alla Anania della mia abitazione
Per valutare meglio quale fosse l'efficienza di questo vantaggio selettivo abbiamo eseguito un secondo esperimento nel quale celle tradotte sono state diluite cinque volte concede un trust dotte in queste condizioni sperimentali l'espressione percentuali vince fra Sector peccati praticamente a livello dei controlli negativi quindi Jeff Sector diventa praticamente non rilevabile mentre Jeff settore ancora espresso in un quattro per cento circa
Di animali trapiantati con tipo R di nuovo questa percentuale non aumenta se effettivamente trattamento con eritropoietina durante il primo mese quindi durante la così costituzioni Amato politica mente assistiamo aumento di tre volte
Se il trattamento viene effettuato cinque mesi dopo il trapianto
In questo ultimo esperimento di trapianto di midollo osseo nel quale veniva utilizzato il modello Murino abbiamo voluto confrontare le diverse configurazioni vettoriale quindi diversi livelli livelli di espressioni tipo R
è quello che abbiamo visto è che la it's over espressioni tipo R che promosse in pratica dal vettore riportato a destra in questa diapositiva non aumenta la percentuale
Di espressione di Angels setto a livello del cioè midollari totalità presentati in grigio non lamenta questa percentuale nelle cellule staminali le progenitrici rappresentare in azzurro e neanche nelle cellule melodiche mentre assistiamo anche aumento del vantaggio selettivo a carico del comparto e ritrovi via questi topi inoltre i topi diciamo trattati col lettore che i per esprimere che può R. presentano anche una riduzione dei valori di ematocrito seppure all'interno del range di normalità
Per verificare questi dati e qui concludo con una diciamo che utilizzando un modello umano di trapianto di midollo osseo abbiamo tradotto cellule staminali progenitrici CD trentaquattro positive
Di sangue di cordone ombelicale con un vettore lenti virale che esprimeva che poiché abbiamo trapiantato queste cellule in topi note scritte
Evito i dettagli insomma che riguardano il vettore lenti viarie Vanni in via sperimentale e vorrei soltanto sottolineare che
Gli animali trapiantati con cellule che poveretta s'dotte presentano un vantaggio selettivo di cinque volte rispetto agli animali di controllo
Possiamo quindi concludere che ti può R. effettivamente agisce come marcatore
Come marcatore di selezioni in vivo e quando diciamo tradotto con retrovirus conferisce quindi un vantaggio selettiva cioè staminali ematopoietiche questo vantaggio selettivo si instaura preferenzialmente durante la fase di ripopolamento
Anche se abbiamo osservato un vantaggio diciamo indurci bile davvero poche Tina nel periodo della post ricostituzione inoltre libera espressione di tipo R determina diciamo non non aumenta il vantaggio selettivo quanto meno non lo fa in modo significativo
E determina soltanto un ematopoietiche leggermente perturbato
Concluso la possente positiva ci sono le persone che hanno partecipato a questo lavoro
Grazie per questa lucida ed esauriente comunicazione ci sono Albania
Aree
Cito si benigna e i pazienti che hanno queste modeste e Alda D'Ubaldo adesso io non così India nel senso che non è una trasformazione o plastica ma questi pazienti hanno valori Nobile a così alti che devono essere continuamente s'abbassa e allora io vivo possiamo immaginare di portare avanti
Faccio
Allora intanto vero questi pazienti è vero che presentano problemi aumento dell'ematocrito anche infarti del miocardio precoci però in modo molto variabile indipendente dalla del tipo di lesione genetica
E spesso la percentuale di pazienti che presenta questo tipo di problema e anche piuttosto scarsa all'interno delle varie famiglie quindi questo per rispondere
Al primo problema
A questo va aggiunto che noi non abbiamo osservato aumento dell'ematocrito in questi animali le contee risuscitare i leucocitaria non perfettamente normali
è anche vero che non abbiamo superato il quaranta per cento di trasduzione in vivo quindi è ovvio che bisognerà andare a valutare gli effetti sulle rive poi si con una efficienza suzione più elevata insomma che si approssima alla totalità del midollo osseo
C'è anche da dire che è un aumento dell'ematocrito nella terapia genica di malattia genetica come la talassemia dove comunque di base su una linea potrebbe insomma non essere un problema e se in qualche modo compensata dalla condizione di base che si vuole sottoporre a terapie geniche questa seconda domanda mi ricorda la prima per cortesia
Così era per te una
L'unica alterazione che abbiamo osservato una riduzione dell'ematocrito dà un valore medio del quarantacinque per cento
Degli animali di controllo trapiantati con gli altri vettori ancora anche uno per cento
Abbiamo ipotizzato dal momento che quello e il il gruppo di animali trattati con il vettore che ho per esprimere in tre D bimensile recettore esprime quindici volte di più della normalità abbiamo ipotizzato che questo potrebbe derivare da una sottrazione di eritropoietina a discapito dell'emopoiesi
Normale residua in questo caso è normale ovviamente trattandosi di Tor pisana
Di scusate potrà interrompere la discussione su questo che dobbiamo andare avanti di nuovo complimentandomi nella prossima relazione che riguarda me che diciamo la l'aspetto di differenziamento di cellule
Evito poi etiche cioè meccanismi durante difensivamente Cerrito politiche ruolo
Fondamentale di un qualcosa che non pronuncio ma che poi il dottor Carlo mischiati dell'Università di Ferrara del gruppo Alberto gamba eccetera velocemente grazie
Sì
Il quello di cui parlerò oggi qui sarà appunto della le quelle che sono le nostre evidenze sulla coinvolgimento della proteina fra nella differenziamento ritrovate
Come venne sapete l'abito talassemia una malattia ereditaria dovuta al malfunzionamento della dell'emoglobina adulta dovuto ad anomalie genetiche occorrenti nella nel genere l'occhio dell'abitacolo Bina
Esistono però degli individui che sono venute alla semplici
Che sono in grado di sopravvivere tranquillamente cioè di di aveva avere una vita normale sono praticamente asintomatici fino al momento del prelievo e questi in e individui mostrano nella nel loro sangue altri livelli di emoglobina fetale vengono definite appunto H P F H questo fa pensare che la vita normale in questi pazienti sia dovuta alla al praticamente al rimpiazzo della funzionalità del nucleo Bin adulta con una l'emoglobina fetale
Dante quest'osservazione da anche lo spunto per una possibilità cura per la verità la semina potrebbe appunto consistere nella in una terapia in grado di fare esprimere i geni gamma di obici
Inducendo fenotipo HP a Sciacca di tipo farmacologico ovviamente un farmaco che potrebbe essere utilizzato a questo scopo
Deve possedere due caratteristiche basilari di essere bassa avere una scarsa tossicità ed avesse negato di appunto modulare l'espressione igienica Mario quindici ma soprattutto di produrre accumulo di emoglobina
E tale noi pensiamo deve diventa identificato un farmaco di questo tipo ed era Pomicino farmaco noto della Why Ettore prende il nome anche dire accomuna con secoli Musso
Questo composto è una una molecola bersaglio specifico che lega in modo particolare un recettore cito solo amici cito sonico che la proteina SKG dodici il Complesso proteina fare una collega a sua volta una proteina la proteina Fratto
Esiste un altro composto altri due composti che sono in grado di legare la proteina secca periti dodici che prendono il nome di tacrolimus che Ascom Ucina f k cinquecentosei e Ascom Ucina
Questi però che per questi il complesso farmaco proteina se K non interagisce con la proteina fratto ma interagisce con un'altra proteina che la calcina urina quindi una peculiarità della Raponi Cina è quella di legare l'asse cave di dodici e di inibire la proteina Fratta
Beh intera scappare sottoposto sottolineato questo aspetto perché appare interessante come Leffe K cinquecentosei Vasco mi Cina se somministrata il terreno agricolo di coltura di K cinque sei due
Non sono in grado di indurre livelli di mobilizzazione emoglobina di trazione in queste cellule mentre invece Lara Comi Cina lo è inoltre al al diciamo al punto in cui la rapa vicina dai il massimo alla concentrazione aquilana Pomicino dal la massima effetto su differenziamento e ritrovi de non è assolutamente tossica
Questo punto fa pensare che per le caratteristiche perché ne vogliamo inoltre è in grado di indurre l'espressione del gene della gamma più abbina siamo incapaci per sei due è in grado anche di produrrà cumulo di emoglobina fetale al con un magnitudo doppio rispetto a un un farmaco di riferimento che viene già utilizzato in tre clinico che è il l'idrossido urea
E ma soprattutto fa questo anche nelle dei precursori ritrovi è in grado di indurre l'espressione di chiamarlo Pina
E questa forse la slide su cui accentrata ridiscussione è importante perché è in grado di indurre su accumulo di emoglobina fetale nella precursore ritrovi di pazienti e beh tutta la sedici donatori beta talassemia ICI non solo ma il livello di emoglobina fetali condotta in questi pazienti raggiunge livelli simile più tenuti nel negli individui HP f h
Quindi questa caratteristica associata al fatto che la Panici ma non ha un effetto tossico
Il conferiscono delle caratteristiche perché permettono di ipotizzare un possibile utilizzo nella cura della Pet dalla semina questi dati li abbiamo riassunto in un la recente lavoro apparso sul British Journal ma Paolucci del due mila quattro
Ci siamo chiesti quindi arrivati al punto ce l'ho chiesti ma in che modo la Pomicino svolge la sua azione differenziando e cioè è possibile copiare meccanismo era più vicina per identificare nuovi composti magari non brevettati
E che possono essere utilizzati per la cura della beta talassemia
La la abbiamo cercato di capire quali fossero i meccanismi molecolari alla base del funzionamento
La peculiarità della ravvicinati punto la capacità di inibire questa proteina Fratta che sta per se K cinquecentosettanta cinquecentosei rappa mai sin Associated proteina
Questa proteina importante perché regola la traduzione nelle nella cellula di conseguenza regola il ciclo cellulare la crescita cellulare fondamentalmente sì a insegna la parte di far che si diparte palle di Fratta e si divide in due vie che vanno fondamentalmente a fosforilare questa proteina la P settanta stesse chinasi
Quest'altra proteina che invece l'acqua quattro di più uno il pathway in cui è compresa la proteina frappè abbastanza Complesso semplicemente da un lato appunto abbiamo la fosforilazione t. settantasei chinasi che a sua volta come va a fosforilare la proteina riposo male e se sei e mediante questa via la cellula in grado di promuovere la traduzione di messaggeri che posseggono un cinque primo top dall'altra via l'impianto come ad esempio i geni per la propria riposa Minali oppure i geni perle
Lo chiedo somali e il va be'in
Beni per l'altra spetta va be generi proferì enormi ali dopo viene in mente
Dall'altro avvio a
Ai geni si delle dei fautori di elongazione della sintesi proteica illa dall'altra vi è invece Fratta in grado di modulare la fosforilazione D quattro D più uno non è in grado di Fosso Reale direttamente
E la frustrazione di questo ro quattro e di più uno fa sì che si distacchi Dalì iniziatore della trascrizione
Questo e gli F quattordici questo proteine a sua volta si lega al cinque primo ko di particolari messaggeri tra i quali i messaggeri per i geni delle cicche inchinarsi né che e causa appunto alla latta traduzione
è un pattern abbastanza Complesso verso corro
Quello che abbiamo guardato appunto cosa succede nelle cellule nel mi densamente nelle capaci per sei due signor entrato con la rapa vicina la fosforilazione di della proteina S sei che al substrato drappi settantasei chinasi
Viene notevolmente inibita già concentrazioni al già la consultazione alla consultazione di una nana mollare che era una concentrazione che dava già un differenziamento ritrovi del sostenuto inoltre la questo tipo di fondi fosforilazione Veni vita anche in precursori e ritrovi venire un sistema più fisiologico d'altro canto dall'altra parte invece la rappa vicina in grado di indurre la fosforilazione lì per fosforilazione di quattro e mi più uno
Già sempre a concentrazioni che inducono il differenziamento ritrovi tre quindi appunto questi sono i dati che abbiamo osservato sembra che il differenziamento elettroniche
Abbia la necessità dei veneti di avere una blocco della attività di questa proteina e invece una chitarra fosforilazione delle attività di quest'altra proteina
Per quanto riguarda la fosforilazione di quattro vi più uno la frattura propina fra non è in grado di far sfollare direttamente ma funge semplicemente da portaerei di integrazione per in grado di reclutare alternativamente o la protein-chinasi ci Delta oppure la proteina la la la la PK Lella PK bioma Capatti
Che a sua volta ha spostato Della Pietra chinasi queste due vie convergono nella fosse l'azione di Quattrocchi BP uno
Se la Fosco relazione abbiamo ragionato ce lo frustrazioni quattro mi più una importante per il differenziamento loro usando inibitori Della Pietra chinasi o Della Picca Paci Delta che sono appunto sono tutti e due i due enzimi responsabili della Foscolo azione di questo enzima avremmo dovuto bloccare la differenziamento ritrovi ripasso il guasto blocca India
Quello che abbiamo visto appunto che in presenza di rapa mi Cina sui tiene questo differenziamento ritrovi di assegno aggiungono camicina e l'invito e per la pietà che in Asia una forte riduzione lo stesso si osserva per l'inibitore che rottura Renna l'inibitore dell'Anpi capaci delta punto conferma
Che la fosforilazione di quattro di più non evento importante per il differenziamento ritrovi da almeno nelle capaci per sei due
Questo è il la guasta lotti che dimostra come in presenza di questo il controllo la fosforilazione di quote di più nel controllo in presenza di una comicità azioni per fosforilazione che viene attenuata dalla presenza simultanea dell'invito ripete
La via quattro bit più uno in grado di abbiam detto di attivare la traduzione di mi suggerì con Chico primo capo fra i quali i geni del delle cicche inchinarsi abbiam provato quindi utilizzare un un re certo un un farmaco in grado di inibire leciti inchinarsi l'olmo Cina
E come si può vedere un Cina di per sé non è in grado di indurre differenziamento introvabile ma è in grado di
Ridurre fortemente differenziamento di frode
E li citato dalla dall'azione della Rappan vicina per e questo suppone fa supporre che la proliferazione sia un evento importante anche durante il differenziamento cellulare delle capaci procedure contrarie dei come è sempre stato tetto
La prova del nove Squinzi è vero che la fossero stati quattro dei più uno e la e blocco di della fosforilazione DP settantasei chinasi sono due eventi importanti per il differenziamento allora è possibile
Utilizzando composti farmaci in grado di blocchi di produrre due effetti singolarmente indurre differenziamento ritrovi
Noi abbiamo identificato sente l'insulina in grado di aumentare la fosforilazione D quattro D più uno l'atto ottantanove è in grado di inibire la fosforilazione della P settanta se se chi nasi e insieme danno un pattern che proprio identico a quello ottenuto con la rapa vicina cosa succede quindi quando noi somministriamo insieme questi due composte le cellule quello che succede che da sole non danno differenziamento
La cantante nove da solo non da differenziamento quando sono messi in sinergia e smog H ottantanove insulina da non differenziamento che è una magnitudo simile a quello tenuto accollerà Pomicino
Confermo appunto che il questi due eventi sono i sono coinvolti nello differenziamento ritrova questo è il nostro go secondo le conoscere gli eventi molecolari restano la base differenziamento ritrovi deve soprattutto se causati da un meccanismo dare da un farmaco anti Prodi fra attivo
Possono essere utilizzati per i disegni nuove strategie terapeutiche per la beta talassemia e nella nostra ottica appunto farmaci altri farmaci che non sono brevettati citochine ma in modo particolare molecola anti senso che potrebbero essere esempio mole canti senso che bersagliano la la il gene per la disse di settantasei chinasi perché potrebbe essere di per sé in grado di indurre differenziamento
Grazie mille complimenti e per uno studio che non solo colore conoscitivo ma evidentemente enorme valore biotecnologico ci sono domande
Già
Una e considerazione per quello che riguarda il possibile impiego dell'appetito della induzione espressione della emoglobina gamma si sa che pensa a una maggiore affinità dell'ossigeno
E tale rispetto alla emoglobina adulta e che potrebbe comportare dei problemi per il rilascio di ossigeno a livello tissutale e ciò dovrebbe essere associato con farmaci che poi modulano l'attività dell'ossigeno per l'ossigeno per colpire a livello periferico
Io credo che questo non non non so non dovrebbe essere un problema abbiamo l'evidenza vissuta dei pazienti con alta persistenza Imago dipinti emoglobina fetale che dimostrano che a livelli di emoglobina fetale simile a quelli che non riusciamo indurre con i nostri composti
Hanno una vita pressoché normale che non hanno bisogno di particolari trattamenti farmacologici quindi io penso che il problema non non si presenti in realtà perciò
Può essere è possibile d'altro lato non son chiuso che ti vuoti questi però volevo seconde catene gamma quindi questo è l'obiettivo numero uno c'è ridurre la fagocitosi insomma la l'anemia
Ci sono altre domande prego si grande
Avete confrontato nel vostro modello sperimentare l'effetto della rata vicina con altri farmaci sono in grado di indurre H Biesse Comito signore alza Celerina quindi avete un'idea della dell'efficacia
Sì l'ho ho fatto del male positiva c'era appunto nella prima che ho proiettato della carrellata funzione di più sì funziona di più molto di più non solo ma non è tossica
Bene grazie e passiamo alla prossima presentazione che riguarda non nuovo sistema per la quantificazione indigeni il lavoro è prodotto nel laboratorio brucio Magnani della Università di Urbino che viene presentato dottoressa Casa Bianca
Prego gli scarni tempi se possibile la crisi ipoglicemica incombe su molti di noi per cui prima di vedere un intero Flora disteso cerchiamo di studio avverte grazie
Allora
Allora tanti serve una tecnica che permette di monitorare il Etienne amplificati in tempo reale è una tecnica che si basa sulla fluorescenza e l'emissione della facenti infatti direttamente correlata la quantità di prodotto di PCR
Per questo la realtà inficiare permette accurate quantizzazione di DNA
Il sistema di liberazione si basa su sonde fluorescenti oppure su sono coloranti interpellanti BNA come sei Darwin insider dealing quando si intercalate al DNA emettono fluorescenza che duecento volte maggiore rispetto a quella e di quando in soluzione libera i vantaggi dell'utilizzo del Sag blindate sono che non richiede disegno ottimizzazioni di sonde
Per cui abbatte i costi di reazione e di conseguenza aumenta la flessibilità in quanto solamente una corte di prime specifici richiesta inoltre è dimostrato che più preciso e più sensibile
Le applicazioni quantitative sono di due tipi coinvolgono un approccio assoluto o un approccio relativo papà dissoluto non possiamo dimostrare nel settore della virologia nella quantizzazione della malattia residua minima oppure meglio GM
Qual è il nostro scopo lo scopo è quello di allestire è un sistema di rivelazione di versarle che sia efficiente flessibile poco costoso e abbia un ranger dinamico largo e che abbia una sensibilità bassa
Gli obiettivi di questo studio sono quelle di determinare la sensibilità la riproducibilità la specificità e l'efficienza del nostro sistema di rivelazione che comprende un un semplice e adattato sistema distrazione di DNA e narrazione di PCR eseguita con una master mix una miscela che comprende e sei del Rina che è formulata nel nostro laboratorio
Una piccola parentesi d'aprir riguardo l'utilizzazione del vino è questo che se non intaccano ante del DNA
E si può intercalare anche eventualmente indi meriti Pagliaro prodotti non specifici che si possono formare se il sistema non è ben ottimizzato quindi alla fine della della reazione di PCR
E necessario interiore analisi quindi ho un'analisi elettroforetica un'analisi dissociazione della curva
L'ottimizzazione dei parametri di PCR e la selezione del migliore profilo di PCR è stato eseguito attraverso una serie di esperimenti qui riassumiamo diciamo le fasi finali e ci hanno permesso di selezionare
è una concentrazione finale e ventisei berline uno cento mila una concentrazione finale di razze che reference passivo che permette di normalizzare le fluttuazioni di fluorescenza del sistema che di luce cinquanta erano volare
E del nostro e nel nostro caso una concentrazione di MTC alle due di tre mini molare
è noto che insider viene influenza la concentrazione di Michele di Mcc alle due il quale a sua forte stavolta ovviamente influenza la lotta Startac e anche l'agnellino dei premier
Quindi è molto importante ottimizzare la concentrazione di Mcc alle due
Condizione di PCR sono una fase iniziale di dieci minuti e novantacinque gradi per attivare la startupper una fase finale nella quale viene costruita appunto la curva dissociazione
è una fase centrale dove la Milligan restare Jean come in questo caso possono essere anche associati in in questo caso appunto minuto
A sessanta gradi
E a questo punto siamo passati a valutare la la validità della nostra miscela
Un esperimento che prevedeva l'amplificazione di giurisdizioni scalari piedi un plasmide che nel nostro caso rivinto e contenente diciotto SR Renato
E partendo da da dieci a nove ha una copia allora abbiamo tenuto nel in questo grafico come si può vedere una curva standard portava con sé dei bene comunque l'efficienza una sblocca del tre virgola trenta ci mostra un'efficienza del cento per cento del sistema
Un range dinamico di otto logaritmi e una sensibilità fino a cinque copie
Inoltre di parlando del discorso della specifici a della specificità possiamo dire che il nostro sistema è specifico come mostrato da questo grafico
Nel quale abbiamo viene calcolata la derivata negativa della fluorescenza rispetto alla temperatura in funzione della temperatura quello che si vede il picco la di me del della temperatura di melting del nostro amplificato
Per quanto riguarda ripetibilità e riproducibilità abbiamo dimostrato che in un altro sistema a è una comunale ripetibilità riproducibilità con calcolato con una media del coefficiente di variazione rispetto alle molecole
Del nostro plasmide del diciannove per cento del ventidue per cento
E quindi è una ripetibilità riproducibilità di un buon livello
Siamo passati non secondo mani momento a valutare la sensibilità e l'efficienza di amplificazione della nostra miscela comparata a quella di una una miscela che appunto si acquista nel commercio in questo caso era quella della Blai Applied Bae Systems
Dunque per quanto riguarda l'efficienza e possiamo dire che l'efficienza sono comparabili infatti una abbiamo l'efficienza calcolata sulla sorte di meno tre virgola tre tre ventinove che equivalgono efficienza del cento per cento
Per quanto riguarda la sensibilità la nostra miscela con trentacinque punto quarantadue di intercetta rispetto ai trentasette più settanta virgola settantanove
è molto più efficiente con un PD sette virgola sei per dieci alla meno tre
Siamo passati quindi a valutare tre metodiche distrazione classiche che noi abbiamo cercato di snellire nei vari steppe una che si basa sul fenolo una che si passa sulla
Importa se accettata è una metodica che utilizza la parte nasi K
E by passiamo tutti ma resta comunque quello che è possiamo ricordare che ne ha metallica del fenolo è quella che ti ripeto passa accettato si prevede una fase di preparazione del campione una lisi cellulare e comunque c'è sempre una fase di purificazione
Nel caso del fenomeno si basa su una purificazione frenano con a Formia e nel caso del poeta se accettato si basa sulla sulla centrifugazione praticamente dei complesse di proteina ex DS che si formano dopo avere appunto messo il portasse accettato
E inoltre nella fase potesse accettato ci può si può essere una fase opzionale di aggiunta di proteina si K
E il metodo di proteasi più semplici in quanto dopo una breve Visini iniziale e quindi un trattamento dei campioni per sessanta gradi a da tre un'ora a seconda del tipo di campione in DNA e puro e pronta a terra e le PCR
Quindi il il miglior sistema per valutare l'efficienza delle dei sistemi di estrazione eh
Valutare la amplifica abilità di diluizioni scalari di DNA estratto ovviamente con le varie metodiche
Riassumendo in maniera veloce possiamo dire che il l'efficienza di estrazione del DNA estratto con la metodica di fenolo
E Connell è quella di portasse accettato hanno un'efficienza di tre virgola tre che equivale a un cento per cento e sono comunque entrambi specifici
Siamo questa
E per quanto riguarda la la ripetibilità è la riproducibilità anche in questo caso abbiamo valori equiparati come si può vedere da una media di coefficiente di variazioni per quanto riguarda sia la procedura che utilità fenolo che portasse accettato sette quattro per quattro e per quanto riguarda la riproducibilità diamo un tredici e tre un sevizio quattro
Siamo passati poi la comparazione delle metodiche distrazione che prevedono l'utilizzo del fenolo è della metà dei capistazione che non prevede e nessuna purificazione finale del DNA
Anche in questo caso è stato dimostrato un'efficienza di amplificazione e mostrato dal dall'ASL otto di tre virgola tre tre virgola tre
Il che significa che entrambi i i due il tram le procedure distrazione hanno efficienza del cento per cento
Passiamo alle applicazione quantitative nel settore della Chirurgia non ci siamo occupati della quantizzazione del DNA proverà Ale con un approccio assoluto nel senso che i nostri risultati sono dati come numero di copie per cellula
E l'approccio poco assoluto utilizza o una curva standard e una corretta e accurata misure del DNA viene utilizzato nelle reazioni di PCR
Oppure ci possono e ci possono utilizzare due curve standard una per il target e una per il reference ed oggi no
Abbiamo validato alla nostra miscela di reazione nella quantizzazione delle Prodi russe
Del di M cinque di provinciale nel modello Murino di immunodeficienza
E i tipi di Campione il tipo di Campione che abbiamo utilizzato in questo esperimento erano tessuti e cellule sono state estratte con la metodica di procreare con la perché prevedeva la Prati nasi K i saggi utilizzato era la PCR che prevedeva la nostra miscela
E il range dinamico che abbiamo tenuto era di otto logaritmi la sensibilità di una coppia il tipo di quantizzazione provvigionale era quello che prevedeva due curve standard una per i virus e una per il reference interno
Questi sono i risultati che abbiamo tenute brevemente possiamo dire che siamo stati in grado di quantizzare il DM cinque di pro virtus che il retrovirus appunto
Da valutare in questo tipo di esperimento quindi le coppie che si sono date per numero di cellule siamo stati in grado di quantizzare un numero di integrazioni di IBM cinque ticket partono da tre copie per cellula
E abbiamo rilevato nelle nei linfonodi dei tessuti dei dei topi infettati
Fino a
Una copia per mille cellule nel tessuto in questo caso il cervello di topi infettati e trattati
Questa questa siamo ultimamente ci stiamo occupando della quantizzazione dell'HIV del carico proprietaria di HIV i macrofagi e inetti densi
Il tipo di campione sangue ora Cellule nelle tattiche d'estrazione sono quelle che preveda la purificazione col se no no egli appartiene al si metta da perimetro di portinai sì il saggio sempre prevede sempre utilizzo della nostra miscela e rende di quantizzazione disse logaritmi la sensibilità è una o due copie
E la quantizzazione si basa in un primo caso nella nell'utilizzo di una doppia curva standard una per l'HIV è una per deferenza endogeno
Quando andiamo a quantizzare i macrofagi i macrofagi e nell'altro caso invece abbiamo una quantizzazione che si basa sul corrette accurato dosaggio di DNA lo spettro fattomi entro è una curva standard
E questi sono i risultati che abbiamo ottenuto ottenuto nella quantizzazione di DNA virale nei macrofagi umani infettati
Trattati con degli specifici farmaci antiretrovirali qui dimostrava la curva standard connesse logaritmi di efficienza e una efficienza del al cento per cento questa precisamente novantotto per cento
E sotto mostrato praticamente la quantizzazione che è stata eseguita non su questi punto
La Croff oggi infettati e trattati con le vari farmaci e le sono espresse nell'asse delle Y le molecole di HIV per dieci mila Cellule e nell'asse delle Y le condizioni sperimentali siamo stati in grado di quantizzare un numero di copie che vada circa quattro mila moglie collettive per dieci mila cellule fino a circa cinquecento Cellule per quindici mila copie
L'ultima parte riguarda la quantizzazione dell'HIV nitidi anzi ancora una volta sopra e mostrata la curva standard con un'efficienza il cento per cento una linearità di sé logaritmi
E in questo grafico è uno stato praticamente la quantizzazione delle molecole di HIV espressa per dieci alla Setti dialisi
In funzione del
Del carico virale di RNA
Quello che si può notare e che siamo stati in grado di quantizzare i letti e ne aprirà le nitidi enzimi sia in campioni che avevano un contenuto di DNA di RNA virale sotto cinquanta copie pere e mele
I così detti considerati alle tette volto
Fino a dei campioni che avevano un contenuto di il del rene attere Mele di sangue che andava arrivava fino a cinquecento mila copie per e mail
Il sistema è efficiente specifico riproducibile Renzo dinamiche sei otto logaritmi e ha un limite di sensibilità di una cinque colpi come range dinamico sensibilità che possono essere necessari quando si monitorizza no infezioni retrovirale in risposta particolari farmaci quindi il nostro sistema è un sistema di quantizzazione universale semplice da usare elimina l'acquisto di specifici kit di estrazione di DNA e di PCR ringraziò chiara la mia collaboratrice professor Magnani
Grazie per la chiaro e convincente esposizione va detto che qualunque metodo che ci perché si prefiggono di abbattere i costi delle frequentazioni con questi chiari di luna processo lo salutato tutti noi con grandissimo entusiasmo
E c'è tempo per una domanda
Prego richiesta
Domanda tecnica che tipo di accusate
Capita che tipo Rita usate
Otto Astarte attacca della di attiva
è un'altra brevissima domanda sensi sentito avete provato a correlare
I dati ottenuti
Per il cene targhette con quelli ottenuti la matita scusi ritrovata correlate i dati Dacourt contenuta per mettere targhette con quella oggi cioè c'è una correlazione perfetta fra dati ottenuti congiungere targhetta e dati ottenuti
Allora non sono mostrati tutti i risultati comunque ogni tipo di esperimento
Ha aveva la correlazione fra la curva standard è la curva standard referenze e l'efficienza sono state sempre dimostrate essere del cento per cento
Io alla fine non ho potuto puoi spiegare meglio ma nella quantizzazione del DNA provinciale dal Pd anzi nel partiamo da un da un microgrammo di DNA per reazione di PCR
E comunque la curva standard è stata costruita condizioni plasmidi che in un background di micro grammo di DNA per far sì che il sistema comunque sia valido anche e sia correlabile sia quella curva stando a mettere con il il DNA anche mettevano ATCR direzione APCR
Questo sicuramente è stato sempre far
Bene grazie non c'è tempo per contrario escussione passiamo all'ultima la prossima e ultima comunicazione la mattinata presentato dottoressa attirò del gruppo del professor Messina e riguarda i meccanismi di resistenza che nelle chemioterapica in Cellule indifferenziate tumorali natura tutti noi prego
Il lavoro di cui vi parlerò appunto dei meccanismi di che nel resistenza in celle di carcinoma indifferenziato della tiroide si tratta il lavoro svolto da me dalla dottoressa Consoli
Presso il Dipartimento di Scienze biomediche dell'università di Catania diretto dal professore Angelo Messina
La tiroide è una ghiandola endocrina costituita da follicoli come si può vedere in quest'immagine in alto delimitata dall'epitelio follicolare nel caso in cui a livello dell'epitelio fili colare si registrò modificazione di tipo cancerosa
è possibile distinguere tra diverse forme di cancro della tiroide
Abbiamo il cancro di tipo Papini farò in cui lascia il follicolo assume una struttura papilla il cancro di tipo follicolare in cui è persa parte dell'organizzazione originaria del follicolo
E il carcinoma di tipo anaplastico dove non si ha più nessun tipo di organizzazione
A livello follicolare avviene la sintesi degli ormoni tiroidei per cui è necessario che il follicolo stesso Catti lo iodio
La capacità di trattare lo iodio che si registra anche nel caso dei cioè le di di cancro della tiroide nel momento in cui il paziente
Viene colpita dal cancro della tiroide a seguito di asportazione della della massa cancerosa
Sì prevede la terapia prevede l'utilizzo dello iodio radioattivo dello iodio centotrentuno che però risulta essere efficace solo nell'ottanta per cento dei casi di carcinoma follicolare
è e carcinoma Papini farò macchina è completamente inefficace i casi di carcinoma anaplastico della tiroide e nel restante venti per cento in questo caso si preferisce utilizzare la chemioterapia farmaci come il cisplatino
Da Doakes ero vicina è il TAR solo facilmente però queste linea di carcinoma della tiroide ma l'incontro a resistenza cellula resistenza alla morte così come viene riportato in letteratura
E come abbiamo voluto noi verificare mediante delle conte di vitalità cellulare
Innanzitutto è necessario direi che le linee che abbiamo utilizzato per il nostro studio
Sono due derivate da carcinoma di tipo Papini di ferro si tratta delle Anco TG uno e delle DC pappa due linee sono derivate da carcinoma di tipo follicolare si tratta delle prove e delle feticci centotrentatré e perline derivano dal carcinoma di tipo una prassi con le carte quattro l'SV mille settecentotrentasei e le otto tre zero cinque cinque
Queste linee sono state trattate per i tempi quindi calati con diversi chemioterapici in questo caso mostro la curva di vitalità per dopo la trattamento di queste linee con il cisplatino
Le dosi utilizzati sono le dosi massimali così come vengono riportate in letteratura
Come si può vedere assedio di settantadue tazze da settantadue ore dal trattamento con il chemioterapico in media si ancora il venti per cento discende che resiste alla morte
Lo stesso abbiamo tenuto nel caso della Doxa ONU piscina anche in questo caso circa il venti per cento delle cellule in media anche se l'andamento delle curve diverso
Esiste al trattamento con il chemioterapico migliora i risultati sono se ottenuti con il taxi solo anche se in questo caso il resistenza alle settantadue ore del trattamento rancore di circa il dieci per cento
Si sa è riportata in letteratura che la resistenza delle linee di carcinoma della tiroide al trattamento con i chemioterapici o dipende da diversi fattori o da una versione della glicoproteina P e delle multitraccia esistenza proteine
Ho a un incrementata attività del citocromo p quattrocentocinquanta o da una capacità maggiore da parte della cellula di poter andare a riparare il danno del DNA oppure quello che a noi interessa che sia dell'inibizione a livello della cascata Coppito gotica
Infatti è possibile ipotizzare che siano coinvolte delle proteine conosciuta come inibiti riceve l'apoptosi o come gli attori
Si tratta di proteine che sono fondamentali nel processo botte ottico visto la loro capacità di andare a bloccare le caspasi proteine che entrano in gioco nel processo portò Tito appunto
Speriamo su cui abbiamo no esso formato l'attenzione sono io uno due su divina ex attore
Nel lavoro nella presentazione mi occupo principalmente di alcuno io due e distrutti divina se atto ancora abbiamo dei dati preliminari che dobbiamo verificare
Oltre ad occuparci della delle gli attori il nostro studio si occupa anche di stima Diablo si tratta di una proteina mitocondriale che non normalmente a segno di stima l'apoptosi bobine rilasciata nel citosol
La ma Diablo alla capacità di andare a bloccare l'azione delle Iap
Permanente infatti le caspasi e la loro attività viene bloccate dal dal conte
E quel dal complesso con lei atto e con essa quindi viene bloccata l'apoptosi nel caso in cui è presente sì ma Diablo quindi viene liberato nel citosol
Viene bloccata l'attività del dell'inviata è nata Stasi e liberati poter svolgere la sua funzione e quindi di indurre l'apoptosi a livello delle cellule
Scopo del nostro studio è stato quindi quello di andare a valutare se farmaci differenti potessero in qualche maniera determinare una modulazione nell'espressione delle gli atti quindi incatenati stima Diablo e anche una loro localizzazione ipotesi sperimentale fatta è che nel cancro della tiroide in particolar modo in quelle linee che sono insensibili all'azione del radio iodio assegno del trattamento con un chemioterapico si potessero verificare diversi meccanismi
Perché ritmi che possono avvenire contemporaneamente o anche singolarmente
Il primo è che il trattamento con il chemioterapico mi determini un incremento nell'espressione delegato quindi una maggiore possibilità per lei atto di poter compie Sassello al alle caspasi e di bloccare quindi l'apoptosi oppure che il chemioterapico
Pineta armi un decremento nella quantità di stima Diablo rilasciato di conseguenza gli alcuno a e lei gli atti in generale possono più facilmente legare le caspasi è in questo caso inibire la porta voti
Uno dei primi esperimenti fatti è stato quello di andare a verificare se le linee che noi stiamo utilizzando per il nostro studio esprimevano lei appare stima Diablo e così è stato come si vede di tutte le linee utilizzare per il nostro studio sono presenti lei atto
A questo punto abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla propina ricordo che l'ipotesi fatta e che il trattamento con il chemioterapico potesse determinare un incremento delle delle IATA ed è quello che noi abbiamo trovato qui mostro i risultati per i appunto e gli altri due a seguito del trattamento con il chemioterapico Tazzoli ha una concentrazione cinque micron volare si nota un incremento nell'espressione delle Iap
In questo caso nella linea però nelle carte quattro e nelle otto tre zero cinque cinque anche nel caso del del della proteina Hyatt due ritroviamo negli a un po'di Giunone le bici parte negli otto tre zero cinque circoli incremento della stessa
Per brevità è possibile dire che sulle sette linee che stiamo utilizzando per il nostro studio in sei casi su sette si ha un incremento di alcuno top trattamento con il Tazzoli e infettati su sette siamo incremento di a due dopo il trattamento con il taxi solo anche nel caso di Sud velina abbiamo trovato un incremento nell'espressione di questa proteina sia dopo trattamento con il cisplatino sia dopo trattamento con il taxi solo anche in questo caso mosso soltanto tre delle linee utilizzate per il nostro studio ma in generale è possibile dire che sulle sette linee in cinque casi su sette sia un incremento di su velina dopo trattamento quel cisplatino
E in cinque casi su sette siamo incremento disordinato potrà altamente o con il taxi solo la seconda parte della nostra ipotesi era quella che è assente del trattamento con il chemioterapico si potesse verificare
Un decremento nell'espressione di stima Diablo ed è quello che abbiamo trovato dopo trattamento delle linee tira idee del nostro studio con il taxi solo qua mostro li ha un po'TG uno lei feticci centotrentatré elenca quattro
In generale esso stesso le sette linee che noi stiamo utilizzando per il nostro studio in cinque casi abbiamo avuto un incremento di stima Diaco dopo trattamento con il taxi solo successivamente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla localizzazione del delegata e abbiamo verificato se sapeva di trattamento se avesse una ridistribuzione delle app a livello del delle Cellule
Il lei nelle figure di in una fluorescenza e l'abbiamo colorato i nuclei in blu in rosso era indicata la proteina di mia interessa è il verde abbiamo colorato il citoplasma in particolar modo lattina
Come si nota dalla nella prima rigati alcuno è una proteina nucleare infatti se sovrapponiamo come si vede nella figura colori
Il blu del nucleo con il rosso di gli alcuno otteniamo un viola come vedete e a Puno sta a livello del del nucleo dopo trattamento Allevi con il taxi solo dopo ventiquattro ed al trattamento con il tax solo notate come io a Puno si distribuisca dal nucleo anche nel citoplasma
Permane ancora come si vede nella figura colori un colore violaceo a livello del nucleo ma sia anche una ridistribuzione del colore rosso in in tutta la cellula che si nota anche a a quarantotto ore dal trattamento con il terzo polo
Anche nel caso di sì ma di Abbio abbiamo verificato una migrazione dello stesso in questo caso i nuclei sono stati colorati sempre in blu il rosso i mitocondri perché ricordo che stima di apre una proteina mitocondriale e ma Diablo in da da eh sì ma Diablo fosse la proteina netto mitocondriale si verifica anche dal fatto che è la sovrapposizione del verde di stima Diablo con il rosso di MiTo contro mi dà un giallo arancio
Come si nota nella figura a colori sana completa sovrapposizione della delle due immagini nel momento in cui si tratta con il taxi solo alle ventiquattro ore si nota non ridistribuzione del colore dei mitocondri mitocondri infatti nel non trattato sono abbastanza punti nati mentre qua si vede che il rosso è molto diffuso
Mentre è possibile dire anche se non diavolo rimanga ancora compartimentali imputato all'interno del dei mitocondri Stassi infatti è la figura colori si vede come sia una giallo
A livello della sovrapposizione del verde di stima Diablo con il con con il rosso dei mitocondri danno che si nota maggiormente anche alle quarantotto ore
E così via quindi ipotizzare che semina il trattamento il chemioterapico
Il la resistenza che le linee tiroidee presente o no al trattamento con il farmaco stesso possa dipendere dal fatto che soltanto parzialmente stima Diablo venga rilasciata nel citosol
E che assolta la maggior parte di esso rimanga legato ai mitocondri
In conclusione è possibile dire che le linee nitide o voi perché ne abbiamo utilizzato per il nostro studio esprimono tutte quante le Jatta e SMA Diablo
Che differenti chemioterapici possano in qualche maniera determinare un incremento nell'espressione del lei attacca un decremento nell'espressione di stima Diablo
E che matematici differenti mi possono anche determinare una ridistribuzione a livello cellulare in questo caso mostrato di lì a Puno e di stima Diablo
E quindi è possibile ipotizzare che queste alterazioni molecolari possono essere coinvolti nella Resistenza ai chemioterapici che s'serba nelle linee di carcinoma della tiroide indifferenziato grazie
Grazie per interessante comunicazione anche più se è stata perfettamente in tempo molte pressato ci son domande
Nessuna problemi con la tiroide
Se non delle ringraziamo anche appunto perché siamo veramente al limite del tempo e vi prego un attimo di osservare quello che verrà proiettato che sono comunicazioni l'organizzazione Grassi arrivederci petardi
Buonasera a tutti insoluto grazie per essere qui con noi a nome mio personale dalla professoressa Bossoni volevo prima di iniziare la sessione dare un'informazione
Che come Sisti devono prenotarsi entro le sedici presso la segreteria se vogliono partecipare alla cena sociale questa è l'ultima dead line per potere partecipare alla cena sociale che sarà stasera
Allora grazie ancora allora vedete che l'organizzazione abbiamo cinque comunicazioni
La prima comunicazione come d'uso in queste giorno in questa tavole avrà un tempo superiore quindi complessivamente circa mezz'ora
Mentre le altre hanno quindici minuti dodici di presentazione e alcuni minuti per le domande quindi vi prego di mantenere i tempi spero che abbiate preparato tutto in questa direzione
Alla prima l'onore di presentare la professoressa Bolzoni che insieme a De Angelis stand rosa
Denti presenta avrebbe Gin Feralpi offro annuali mai occupati se io uso avanti senza arnesi Ford e modifiche Jeanette posta Simpson leva ovvio che che distrusse intra nessun giornale ne grazie Irene atte
Scusate per la voce che stampa traballante notturno tra Kate in corso il
Dunque vi racconterò forse alcuni di voi ci hanno sentito buona parte di questa storia i nostri sforzi ha in un tipo di possibile terapia genica per la distrofia muscolare di Duchenne
La strategia
Dunque è un po'ambizione di tutti quanti noi riuscirà a trovare dei mezzi attraverso i quali si riesca a controllare l'espressione genica in maniera sequenza specifica
Quello che cercherò di illustrarvi sono i vantaggi nello sceglie la l'RNA sia come target per questa al controllo dell'espressione genica sia Khan che come e settore di modifiche che possono essere operate a livello seguenti trascritte
E quali sono i vent'Agip di utilizzare molecole di RNA sia come target che come e settori di questo controllo innanzitutto perché
Come sapete
E in questa maniera si può interferire a molti diversi utilizza scegliendo l'RNA come target si po'pensare di poter interferire con l'espressione genica morti diversi Mirella trascritto primario
Alla maturazione del trascritto al trasporto la stabilità e la traduzione della dell'RNA
Secondo poi perché utilizzare delle molecole scettici di RNA perché è stato visto che interazioni anche molto corte quali venti nucleotidi conferiscono totale specificità di interazione all'interno della tre della cellula
Quindi una amo lecco Leffe Trichet dirne anche di soli venti nucleotidi complementare ad un target naturalmente spesso dalla cellula è un'interazione che può portare
Ad effetti
Anche abbastanza drastici nella destino della di quello che è l'eroina targhette vedremo a quali livelli può avvenire questa interazione e colpendo però quali diciamo momenti metabolici e di maturazione dell'RNA e con quali effetti
Da quando si è cominciato a parlare dell'eroina e delle sue possibili applicazioni come molecole in grado appunto di interferire specificamente all'interno dalla cella Kospi civile funzioni si sono assommate tutta una serie di caratteristiche attività
Dall'RNA o meglio di corte molecole dell'RNA per indurre queste modificazioni alcune Sorvino diciamo anche abbastanza antiche come attività attività forse più
Tradizionalmente nota nell'interazione fra Dumas ecco i Deragna è quella dell'anti senza
E di interferenza vari processi che vedremo
La rana come ligando per proteine quindi come sequestratore di Platini all'interno della cella
Sì Bozzini era mai totalmente passati di moda anche se alcuni tirano spessa speso anche abbastanza tempo su questi ma insomma è la storia
La rapina
Era neanche possono modificare i target con i quali entrano in associazione e poi e non per ultima invece la nostra star di questi ultimi anni e questa capacità di alcuni RNA molto corti lunghezza una ventina di nucleotidi di portare a una via degrado attiva l'RNA col quale appaiano
Allora tutte quante queste attività che sono appunto indotte da molecole di renna molto corte venti nuclei timidi possono essere date alla cella dall'esterno in forma di Arena sintetici però chiaramente qui c'è un grosso limite in quanto l'attività
Che viene indotta dalla piccola René all'intera dalla cella dura quanto la vita del Lerna stesso a all'interno la cellula
E quindi questo limite che è stato in parte scavalcato dal fatto di ottenere Arianna sintetici di Pia sempre più stabili in vivo è diciamo definitivamente sarebbe definitivamente
Superato dalla possibilità di avere dei sistemi in cui queste funzioni dell'RNA questa corte molecole vengono espresse permanentemente all'interno delle cellule in maniera stabile
Per fare questo però abbiamo bisogno di tutta una serie di supporto primo fra tutto questi corti RNA devono essere espresse per essere espressi dovrà essere trascritti idealmente da promotori che ne consentano un'alta espressione all'interno della cellula in in nei promotori più diciamo usati in tantissimi studi a questo riguardo sono promotori che trascrivono piccole renana Manente nella cella quali promotori oltre però recentemente ci si è resi conto che molti dei nostri lettori ricorra questi promotori che esistono promotori Paul due sempre che codificare che trascrivo Marcello al quartiere nera ed Anna che vi possono essere efficientemente utilizzati in questo sistema il secondo aspetto che anche molto importante è che questi costi RNA per essere stabile l'interno della cellula devono essere in un contesto di di una molecola che sia diciamo accettata dalla cellula e quindi bisogna immaginare inserire questi piccoli RNA quindi la funzione di questi piccoli alla mia nel contesto di RNA che siano stabilimenti mantenuti nel lasciare la struttura chiaramente importante soprattutto quegli Arianna che svolgono la funzione come questo poteva essere neri Bozzini dipendentemente da loro struttura
Tridimensionale
Ma la cosa più importante di cui ci siamo resi conto nel corso degli anni che in realtà la caratteristica più importante per un vettore che sia in grado di esprimere nella cella degli RNA con tutte le funzioni che abbiamo con ognuna delle funzioni che abbiamo visto prima
è la capacità di poter colloca Lizzani Fitch ampiamente con il suo substrato
Indubbiamente sappiamo che il premiati ammissione diversi momenti matura attivi della cella segue dei percorsi molto ben precisi per cui se vogliamo colpire un RNA in un particolare momento del suo stato mature attivo dobbiamo essere in grado di fare esprimere la molecola e si è trincerata della della specifica funzione in quel determinato compartimento quindi presente se vogliamo colpire un'eroina precursore
La molecola che forse a questo punto potremmo anche chiamare terapeutica
Dell'Europa l'eccezione specifica nel nucleo e non presente nel citoplasma quindi questo alla fine di tutti quanti i giochi si arrivata sicuramente il l'aspetto più cruciale interessante nel disegnare concepire questi vettori
Nel corso degli anni ne abbiamo utilizzati costruiti riversi che utilizzando ossia promotori oltre come questo ma la maggior parte di questi USA dei promotori Purdue
Questi sono geni che codificano alla cella piccoli RNA
E viene modificato il trascritto in maniera tale da avere sia le caratteristiche del picco Lerna cellulare come per esempio uno di rimanere nel nucleo e di partecipare alla reazione display si immagini interno di questo RNA poter inserire la attività terapeutica della rinata interessante che siano anti senso che siano Ribot Zina che sia un atto a me e a quant'altro
Quello di cui vi parlerà oggi specificamente una di queste funzioni che abbiamo applicato al caso specifico della distrofia muscolare di Duchenne e che appunto come dicevo in fondo la funzione più antica e nota del nell'uso delle armi anche loro di era in come molecola anti senso vero in grado semplicemente a pagando sia una cena target di disturbare qualche processo classicamente la gli eleganti senso vengono utilizzati per bloccare nel citoplasma la traduzione dell'RNA
Ma più recentemente è stata anche visto l'estensione di questa dell'altra tecnica anti senso
Nel compartimento nucleare per indurre delle modifiche a livello di maturazione del trascritto primario
Questo è stato inizialmente descritto con successo in cellule in cultura in un caso di talassemia in cui all'interno di un Introna degenera Beta Colombina per una mutazione si creava un nuovo sito display sin critico
Tale che nella maturazione di queste Renna precursore questa Regione entrami catenina incorporata creando un RNA con un codone di stop prematuro
Quello che è stato fatto all'epoca fu di far esprimere la cella un RNA anti senso contro questa giunzione display era stato dimostrato che l'espressione di questo RNA efficiente mente
Induceva quello che viene definito Skip più ovvero ignorare queste giunzioni display si e permettere l'utilizzazione solamente delle giunzioni display sin canoni
Ne abbiamo pensato di applicare
La la tecnica dell'ex URSS keeping nel caso della distrofia muscolare di Duchenne
E al genere in particolar della di strofina questo gente più grande che abbiamo costituito da settantacinque sogni per una lunghezza di due milioni e mezzo di basi
Nella maggior parte dei casi sia delle delle tensioni che delle mutazioni puntiformi nel gente la distrofia provocano la produzione di cordoni di stop prematuri e quindi la produzione di proteine tronche
Una mutazione in particolare che ci è stata fornita dal gruppo di Ricci al mister cattolica di Roma la mutazione in cui c'è una delezione dalle zone quarantotto al cinquanta compreso che succede in questi pazienti
Dopo che viene trascritto questo gene con questa d'elezione
E si e quindi si ottiene questo RNA precursore quando avviene lo splash in questo com'era né Ammaturo si tiene un'ernia in cui c'era una fusione tra le zone quarantasette cinquantuno
Dato che i due zone non solo nello stesso frame quello che succede che dopo qualche nucleotide all'interno delle sale cinquantuno si crea un codone di stop e quindi questo RNA non solo
Produce la tutina tronca ma esso stesso va incontro a quello che la la degradazione degli RNA con codoni distratto prematuri e quindi c'è sia degradazione della Carnia
E matura terminazione della traduzione
Quello che abbiamo pensato e che l'ex husky più poteva a adattarsi bene a questo sistema in quanto che se si fosse riusciti
A indurre lo skipper delle zone cinquantuno dall'RNA messaggero adesso le zone quarantasette cinquantuno sono lo stesso Lilin freme
E e quindi si sarebbe potuto ottenere una proteina più corta ma forse ancora funzionale perché ancora funzionale perché tante di queste delle azioni per esempio questa
La delezione che include anche le zone cinquantuno e che quindi naturalmente darebbe quarantasette cinquanta tutte e due
è una delezione che si trova in nei cosiddetti se ne tipi di tipo BEC che sono asintomatici e danno una lunga fanno diciamo condizioni di vita simile al normale quindi diciamo che la nostra intenzione era quella di trasformare dei fino a tipi di tipo Duchenne inferno tipi di tipo Becker
Per fare questo la l'idea era quella di utilizzare il più possibile a quello che la cellula già normalmente fa
Nella maturare questi tre scritti
Ovvero dovendo interferire con il possesso display si la cosa migliore usare degli RNA che normalmente
Sono coinvolti nello splash sì che molti di questi piccoli RNA riconoscono il loro substrato per appaiamento di basi e modificato in maniera tale da renderli invece che era mia
Promotori di questa reazione degli RNA che inibiscono questa reazione facendo cosa
Sostanzialmente
Ma scusa
Questi sono due regna display SIM uno riconosce cinque primo display saette U due che riconosce il tre primo un altro RNA che abbiamo utilizzato le armi a uno sette che non partecipa alla reazione display sì ma partecipa alla formazione dell'estremità tre primo dei messaggeri però anche questo sempre con un riconoscimento specifico di interazione di base quindi come trasformare un'eroina che normalmente appaia con un substrato per svolgere la sua normale
Funzione fisiologica non rami a chi inibisce
A quella specifica funzione la l'idea è quella di allungare di estendere la regione di appagamento fra
L'RNA che normalmente dovrebbe riconoscere quella regionale in particolare presenta in questo caso è uno che normalmente riconosce il cinque per display sai normalmente solamente per pochi lucrativi ed estendere questo appaiamento a ventiquattro venticinque nucleotidi
Ecco in questo caso è descritto quello che abbiamo fatto con uno con un sette che direttamente non partecipa lo splash sì ma che comunque si è visto poter operare efficientemente anche nel compartimento dell'ospedale sì
Fare esprimere questi Renna con lunghi anti senza interessi si usciva a indurre lo Schicchi un'altra ideale anche quella di fare un unico Renna che porti a questo punto direttamente all'interno della sua sequenza
Una anti senso che corrisponda a una giunzione display si è all'altra quindi anti senso di circa cinquanta nucleotidi e verificare se questo induceva Skip Inc
Questi costrutti che sono stati fatti contro le sole cinquantuno che avevamo visto prima nel nostro esempio di delazione sono stati clonati indetto dice tra viali e poi abbiamo utilizzato un sistema cellulare che prevedeva l'uso di una biopsia da un un paziente che portava quella d'elezione che vi è descritto morta rizzare queste cellule infettate con i vettori retrovirale anni analizzare l'espressione dei trans geni e poi la la struttura dell'Erna Messaggero e l'eventuale produzione di proteine ecco quello che abbiamo visto è che questo Onna
RT PCR
Che con dei costrutti che avevano degli anti senso contro alla giunzione
Al cinque primo raggiunse le altre primo dei due introni che fin cioè in che giorno risale cinquantuno si esce era al tenere un buon livello Drm in cui le isole cinquantuno
Non era incluso questo anche verificato per sequenza non solo ma che le cellule trattate con questi René anti senza riproducevano Di Nola di strofina giardini strofina sono sempre un po'Buttarelli perché ha distrutto in appalto centoventidue d'altro di peso molecolare
Tra vedete che se queste sono le celle di controllo in queste tre casi di cellule trattate con tre diversi Enti senso
Si ripristina la banda della di strofina casoncelli di controllo la proteina facilmente ma incontra degradazione quindi questo c'era ancora getta pensare che la tecnica dello ska ex Miss Kittin poteva funzionare a in Cellole portantina particolare d'elezione a modificare il pattern display Cindy del RNA precursore per la distrofia
Enduro e la produzione di un RNA messaggero che adesso non aveva più non conteneva più le zone cinquantuno ricreando un messaggero corrono per riddim frena in grado di produrre una proteina solo di non tantissime minacci di più corta della di strofina
L'altare
A questo punto abbiamo provato anche un'altra delezione la quarantasei cinquantuno e anche in questo caso quindi un'altra delezione altri giudiziarie display sul sempre con la stessa strategia articolare anti senso contro all'ernia display sino uno e Lerna sette e anche in questo caso siamo riusciti a tenere un buon grado di Ski Pink della delle zone in questo caso lesione quarantatré riproducendo una fusione in inferenze
Va bene tutto ciò però era un sistema cellulare in vitro
E allora come proseguire qui la situazione diventava ben più complicata perché l'idea di raggiungere tutti quanti Dusi ristretti muscolari
Fino diciamo ad oggi dice delle varie alternative che si presentavano era per la distrofia muscolare un approccio di terapia genica convenzionale ma come avete capito il gene immenso quindi e anche nelle forme di CDMA o di Ctm anche parzialmente
Ridotti in grandezza vettori capaci di esprime le proteine messaggeri proteine di alto peso molecolare molto limitativa in questo caso un approccio farmacologico che era da una parte di indurre la Exxon Ski Ping con RNA dati al sinteticamente alla cellula o dati addirittura in vivo già ci sono dei trial clinici
In Olanda in cui vengono dati era mia modificati in circolo nel topo represso nel topo e la domanda è per andare in più trial clinici dell'uomo
Di RNA anti senso tu modificati in maniera essere stabili in vitro addirittura anche in circolo
Che possono indurre
L'ex Miss Kittin tra con gli hobby limiti di un RNA che per quanto si è anche modificato dopo sicuramente qualche settimana non può più indurre alcun effetto
Altra cosa è una traccia di terapia cellulare però diciamo che fino a poco tempo fa tutti quante le speranze che erano connesse con la capacità rigenerante delle cellule satellitare o o con ancora limitata conoscenza di quello che poteva essere cellule staminali muscolari rendeva quest'approccio ancora abbastanza vago
L'anno scorso il gruppo di Giulio Cossu uscito con questo lavoro su Science in cui identificavano una popolazione nel sangue circolante di Cellole Meza angioplastiche
Cellule entrato qui talenti in grado di essere manipolate in vitro di essere introdotte nell'animale ed ha posto introduzione nell'animale queste celle si sono dimostrate ingrato di passare i capillari di entrare nell'endotelio e una volta arrivati nel tessuto di poteri differenziali in vari tessuti tra cui anche quello muscolare quindi questo sembrava una veicolo cellulare ideale nel nostro caso per poter veicolare all'interno del tessuto muscolare delle molecole terapeutiche
Ecco quindi questo riassume le caratteristiche delle Sanciu elastico siccome descritti da Giulia Cosso
E quindi sostanzialmente abbiamo pensato con Giulio associare la l'uso del messaggio Blast o alla la strategia anti senza quindi creare Emesa angioplastiche derivavano dal malato in questo caso il modello animale
Del topo e meddix quindi di prelevare il messaggio Blast il top meddix modificarli con a queste molecole anti senza era introdurre nel nel topo e vedere che cosa successe succedeva
Il modello del Topor meddix è simile a quello dell'uomo in questo caso lo skip in delle zone ventitré
Riproduce c'è una delezione no c'è una pagnotte Esham nel nel topo che crea un codone di stop se viene escluso le sale a ventitré si riproduce a un messaggero con uno per i differenti
Quindi quello che abbiamo fatto in collaborazione con gruppo di Giulio è stato quello di produrre dei lettori Lentini reali con molecole anti senso contro le sole ventitré del top meddix
Di infettare messaggio basti in vitro e inizialmente semplicemente vedere se Nimis angioplastica il topo di Strozzi conveniva di fatto della distrofia in effetti si vede che delle distrofia in la che ricompare per immunofluorescenza
Ma poi di andare nel topo
I primi topi che sono stati sacrificati
Hanno indicato da una parte che l'approccio dell'anti senso e buona qui vedete nel caso di uno sette che si sono tolti iniettati commessa angioplastiche hanno o il vettore
Anti senso sotto il promotore diciassette o sotto il promotore di uno prendendo i muscoli vicino alla sede di iniezione e facendo devo Ester si è visto che di strofinare veniva fatta
Anche se il problema nel nel caso dei la disaggio Blast il topo
E medico secche la colonizzazione di questo di messaggio Plastino ne è così potente come quella che loro avevano descritto nel caso della Sarko Picano il lavoro di science e quindi a quel punto si sta mettendo un po'appunto il l'uso del messaggio basto del di Stratico però dal nostro punto di vista era interessante
Vedere come dell'animale in vivo in effetti questo è il messaggio Plastic nel compartimento laddove arrivavano questa è una fibra
Positiva si vede che le varie fibre
Tornano ad essere positive per di strofina quindi il problema qui è riuscire ad avere una colonizzazione più abbondante del muscolo
Nel frattempo abbiamo pensato anche un altro approccio uno i vettori Aden associati sono direttore estremamente potenti per il muscolo quindi abbiamo visto in parallelo se utilizzando altri lettori un altro sistema
Potessi ma vere nel muscolo di topi distrofia città PM di sa un riproduzione di di strofina
Se le molecole anti senza venivano questa volta iniettate come virus cioè allenò associati che esprimevano al loro interno la molecola anti senso questi sono risultati abbastanza preliminari sono topini che sono stati iniettando un topo certa solo e per questo dico molto preliminare tracci incoraggia adesso fra poco dovremo sacrificare i prossimi si vede di nuovo della di strofinare all'altezza tesa nel muscolo la doveva essere realtà più scuro presterebbe e nel non iniettato non si vede nulla come atteso Terim uno fluorescenza si vede che della distruzione viene fatta comunque questo per dirvi che adesso ci stiamo sforzando attraverso due
Diverse direzioni a cercare di trovare una maniera per veicolare in maniera efficiente efficiente in termini di Colli sezione territoriale queste molecole che in realtà nella cellula funzionale inducono questo ex tipi però a maggior numero di cellule possibile quindi questi sforzi sono ancora in corso
Voglio ringraziare non solo le persone del laboratorio per l'ascolto tutta quanta la parte molecolare manca la collaborazione con Giulio posso con Alberto Oricchio degli spunti Jem per quello che riguarda l'eterna associate penso Ricci della Cattolica che ci ha dato i mutanti umani grazie
Grazie molto Irene per questa stimolante presentazione molto chiara assestato perfettamente nei tempi eleganza che per quello ci sono c'è spazio naturalmente per domande
Qua c'è microfono occluso Magnani
E e possibili immaginare di essere cenere entrambi crebbero
Visto che nessuno dei due Ida quello che vorresti
Sì per quello che riguarda Abu c'è forse ho una speranza di migliorare ancora di più la penetrazione perché se l'iniezione fatte del muscolo in cui la diffusione del virus abbastanza limitato c'è un rapporto di Chamberlain
E adesso Oricchio sta sperimentando né sui topi che se al topo sì da alcuni in circolo pochi secondi un minuto dopo che è stato somministrato BGS pare che abbia GSE aumenti moment per per brevissimo tempo la permeabilità dei vasi e quindi Abboud dato in circolo ai topi secondo Chamberlain dopo questo trattamento compie gesti
Permettono a colonizzata uno spread in rapidissimo di Arvo praticamente total body e questa è una cosa l'altra cosa mi sento Blast ti sì Giulia sta cercando in varie maniere di spezzarsi il cervello su come poté aumentare l'efficacia di questa colonizzazione mettere due cose insieme e si sarebbe l'ideale adesso fra
Poco tempo dobbiamo perché tutto questo e fa parte poi di un Progetto integrato
Chiaramente non solo degli anti senso anti senza una parte del Progetto in cui sono coinvolte tutte queste persone e quindi tireremo un po'le somme e si cercherà di fare delle scelte strategiche
è chiaro che quella che io mi sono resa conto come biologo molecolare che era così bello lavorare colibatteri con con rilievi chiunque o che sia del cono fa esperimento il giorno d'aver i topi sarà veramente una cosa è veramente molto lavoro agli Ahmed X non si accoppiano riproducono quindi tra che programmi un esperimento e l'esperimento realizzate ante sono tantissimi mesi
Quindi diciamo che nella scelta strategica se vengono tenute in conto veramente tante cose diverse vedrà vedremo sarà questo incontro quale sarà una scelta un po'di tutti su quale sarà la strategia da fare ci sono anche altre strategie di potere reale ulteriormente modificare mi sento plastico altre molecole che sempre all'interno del gruppo stati ideati che permettono una maggiore fra diffusione perché sostanzialmente questo tappo è meddix rispetto al Sacco cliccano un'altra forma di
Che nonché Giulia analizzato prima
Non non c'è molta infiammazione quindi la colonizzazione del messaggio basti e meno potente che non quello che lui aveva scritto nel Sarko dedicano quindi c'è qualche cosa che dev'essere però sicuramente diciamo la storia ci insegna che devono essere congiunte più strategie insieme presso quale sia ancora quella da unire a quale cosa pensa ora definire vogliamo vedere i topi iniettati quella veramente Consolo misero topina quindi è molto presto per dirlo
Posso chiederti una cosa che è collegata a questo brevemente la pistola DNA può essere utilizzata anche primo Colari virus in quel caso potresti inserire direttamente nel muscolo destro
Il tuo pittore contromosse sono i bar contro Trotsky queste fatto varie non ha fatto con la pistola e fatto con la perizia manuale di Alberto Auricchio che bravissimo che Letta cinque sei forse non vuole che la sposa e blocchi centodue io lo so questi questi animali Bonanno c'hanno un mese ci hanno dei muscoli che praticamente invisibili per me prego
Sia in questo stesso contesta credo che sia importante anche cosa che
Al vendicato insomma e il tipo di modello che si usa diventa nodale per vedere quanto questo voi applicabile alla fine in patologia umana
E in affetti di poterli Morini per una ragione o per un'altra problemi intrinseci ne hanno egli alla fine e credo che questo sia una cosa che quel messaggio plastici sta provando di andare al Otello animale di grossa taglia
Riproduce la patologia umana più da vicino caso per esempio del golden retriever
Che naturalmente pone ulteriori problemi ma è sicuramente la cosa più vicina anche in termini di di quantità di virus quantità di cellule
Forse popolare scuole dei sì perché chiaramente quando si tratta un purtroppo di questo peso dire facile avere abbastanza Abu da iniettare quando giustamente bisogna fare lo sketch latta
Tutto acquisisse c'è un ordine di grandezza maggiore di difficoltà
Prego scusatemi tanto Plas
E non fai nessuna selezione la trasformazioni una trasformazione diretta dimezzando plastica Enzo segnalata la una infezione con la NASA Sima Samar tassa detti si sa selezionati assieme le selezioni con resistenze
Ah quindi ma soprattutto la reazione altrimenti le fece un po'salata Cenzato efficiente onesta no è elevatissima tengo da otto e del novanta per cento novantacinque vanta sul messaggio lanciato parallela bisogna però volendo a sinistra
Qualche altra domanda
Se no grazie ancora
Adesso passiamo alle comunicazioni più Brevi vi raccomando dodici minuti più tre discussione totale quindici allora la prossima e dottor De Pinto che presenterà insieme ad Aiello Messina Guarino Spagna
Dire Zapparoli espresse in pancia mutagenesi SOGIN spedito il paese Gino fra
Dove più grazie allora innanzitutto desidero ringraziare gli organizzatori per l'invito ENI il chairman della sessione in tram vicende della della sessione
Dunque nostro laboratorio ci occupiamo
Dire fare andare avanti
Non ritengo so come dovrebbe andare
Ok allora suo laboratorio ci occupiamo ormai da diversi anni nipotine
In particolare di Porrini o Carioti che così chiamate dalla diciamo per somiglianza con le purine batterie una famiglia molto vasta di proteine sono state diverse sono state anche cristallizzate l'acquolina evocavi ottica fondamentalmente presente nella membrana esterna dei mitocondri una piccola proteina che secondo modelli i nostri modelli nostri anche altri modelli
Costituisce appunto un porro
Formato da un barilotto Beta
Con un diametro abbastanza ampio abbastanza vasto in modo tale da poter permettere ai metaboliti di attraversare questa membrana e arrivare a membrane terra dove ci sono i trasportatori specifici
Le funzioni diciamo più importanti principale della Punto della della purina ovviamente oltre queste qui appena accennata e anche di di essere un punto di docking sulla superficie dei mitocondri per altre proteine in particolare enzimi
Su chinarsi ad esempio o o anche proteine sto scheletriche e poi ruolo nel recente che è stata arrestata seguito è di
Di essere coinvolta nelle menti che scatenano la l'apoptosi in particolare agli intrinseca dell'apoptosi perché e sembrerebbe in alcuni modelli anche qui ci sono molti lavori anche contraddittori diciamo
Potrebbe far parte del canale che permette la fuoriuscita del citocromo C dallo spazio interne imbranati
E in questa sì sì in questo diciamo in questa questo tolto in particolare io vi racconterò qualcosa sulla sulle poi Drosophila melanogaster lo sapevano casse unico carioca modello molto importante uno dei primi
Si può dire il primo carico tra superiore superiore nel senso maggiore di delle mille cellule del sì Elegance che è stato completamente sequenziato di cui si ha moltissime informazioni da un punto di vista genetico
Quindi del ed è stato è sempre stato un riferimento per gli studi sugli evoca rivolti anche in questo diciamo organismo ne abbiamo studiato abbiamo purificato sequenziato la proteina è abbiamo a suo tempo anche delucidato la struttura del del gene parla per questa proteina
Un gene costituito da quattro estoni in particolare di cui questi tre più questa parte più rossa sono la la zona codificante
Successivamente a questo diciamo questa questo sequenziamento quando è stato completato il sequenziamento il è stato completamente sequenziato il genoma appunto di questo organismo
Abbiamo avuto tra virgolette una sorpresa cioè sono stati individuati e in particolare molto vicini alla al gene che noi stessi avevamo presentante sequenziato altri G tre geni pori l'Aic
Perché Parrilla e che intanto perché strutture molto simili in particolare concentrata nelle zone codificanti e poi perché le sequenze relative alle alle Coding sono fra di loro a non presenta un notevole grado di omologia
Allora in questa situazione ci siamo trovati di fronte ad un classico problema che viene posto dai progetti genoma cioè vengono identificati
Attraverso quali metodologie e soprattutto più informati e col confronto con altri organismi eccetera nuovi geni
O geni candidati a fare qualche cosa di cui non si ha però la conferma una conferma funzionario conferma biochimica molecolare sul fatto che effettivamente siano parte funzionino essi hanno o quello che ci si aspetta facciamo quello che ci si aspetta
Purtroppo abbiamo qualche problema nel trasferimento da Mackintosh PC cesti PC sono sempre meno validi
Allora che cosa abbiamo fatto abbiamo adottato una strategia quindi questo è il problema che ci ponevamo la strategia che abbiamo adottato abbastanza di retta è stata quella di amplificare le sequenze codificanti di questi geni putativi
Mettere un vettore di espressione esprima l'invito indietro e vedere diverse proteine sia la loro funzionalità e poi andare utilizzarli per l'hotel per gli anticorpi vedere questi anticorpi ad esempio la distribuzione tissutale o esecuzione dei vari stadi di sviluppo viene l'insetto abbastanza complesso il
Diciamo la possibilità di esprimere le varie proteina
In abbiamo iniziato in particolare questo vuole già si può dire concluso sul primo di questi geni quello che è chiamato C giudice settecentotrentasette in quella ma per il più vicino al gene
Diciamo iniziale che abbiamo o noi avevamo precedentemente sequenziato ha quindi la pori Inanna pose seguito la chiameremo Dida con uno cuori era uno questo Gene in particolare lo chiameremo Vidach due acquolina due
Ed è quello tra l'altro che alla maggiore grado di identità con la Polina proprio in più
è un gene che ha una cinque primo Thierrée un promotore quindi quello che effettivamente sembrava più o un candidato migliore adesso generalmente attivo di questo gene su questo l'abbiamo effettuato quindi come dicevo tramite PCR l'amplificazione della Coding è inserendoli siti restrizione all'estremità alti a lati gira abbiamo clonato su tutto successivamente vettore d'espressione che un IVA
Alla Coding una una breve coda disse istidina quest'altra figura vediamo
è stata fatta l'amplificazione in vari era mia di vari tessuti nei vari stadi di sviluppo della Mosca e in effetti si vede che anche questo biglietto due effettivamente presente ubiquitaria mente possiamo dire
Comunque questo costrutto dicevamo questo amplificato corrispondente alla Coding è stato inserito
In questo vettore di espressione del quale esprimendo una serie di istidina e ci permette di effettuare una purificazione Maria molto rotto relativamente a sentire
Con una colonnina Dini che all'NTA una vera e propria cromatografia per affinità con cui è possibile attenere
Con un buon grado di purezza la proteina di interesse questa proteina è stata successivamente studiata dal punto di vista funzionale questo in collaborazione con un gruppo tedesco
Il funzionamento di di questa proteina che forma dei poli non è un indiano un sito attivo come si studia si studia provando a vedere che cosa succede quando il canale si incorpora entra in una membrana planare quando entra in una membrana planare
Vedete in questo sistema ci sono due compartimenti qui la membrana che l'unico setto che mette in comunicazione due compartimenti acquosi qua c'è una differenza di potenziale
Se si apre un canale iniziano passa lesioni inizia quindi a passare corrente quindi si osserva che in questa membrana aumenta la sua conducibilità
Quindi si può vedere a un vero e proprio salto di nei livelli di conducibilità della membrana
Quindi io in questo sistema noi abbiamo osservato ad esempio qui c'è il confronto abbiamo fatto per confronto la Corina uno di cui già che già avevamo purificato anni prima come proteina del proprio dei mitocondri
Ma le proteine ricombinanti come vedete sono funzionali
Formano questi canali ognuno di questi salti la presenza all'inserzione di un canale quindi la palina due praticamente in grado di formare canali per il giorno prima conclusione però c'erano delle differenze sia delle differenze di tipo funzionale una delle differenze
Diciamo quindi chiede scritte qui presto queste tracce la dipendenza dal voltaggio a differenza della cosiddetta dipendenza dal voltaggio c'abbiamo visto del sistema precedente che c'è
Qui un un voltaggio applicato è questo vantaggio erano secondo del voltaggio applicato misuriamo la conduttanza c'è una proporzionalità Diretta fa il voltaggio applicato la conduttanza se questo voltaggio viene aumentato
Automaticamente la conduttanza di numero fisso di canali dovrebbe aumentare invece arrivati ad un certo livello vede già trenta quaranta mitico
La conduttanza dal decade
Decade e di non di più proporzionale al voltaggio applicato quindi questo viene chiamato dipendenza lo sa volta c'è una chiusura vera e propria interpretata con una chiusura del canale ora la purina iniziale originale diciamo
La prima bolina a questa proprietà che lo preveda quasi canonica delle purine o Carioti che mentre invece questa Polina ricombinante due per seconda isoforma
Non ha più questo questa proprietà anche se viene alzato a livelli molto elevati voltaggio applicato
Inoltre un altro problema un'altra differenza di un problema e che la purina uno ha una leggera selettività per gli anioni mentre a pagina due a una legge la selettività per i cattivoni
Per capirci qualcosa di ecco questo riassume un po'questi d'archivio racconta
Quindi forma canali è una Corina però a delle differenze va in particolare siamo siamo incuriositi in generale per quello che riguarda la funzionalità di queste proteine
Per il per queste differenze di attività e siamo andati a studiare un po'meglio la struttura di questa di questa seconda Corinna
Andandole a confrontando a confrontare le
Composizione minacci di che l'ampia cosa evidente che viene allorché salta all'occhio è la differenza nella contenuto in aminoacidi carichi particolari dei TIR Vidach due a molti più amminoacidi
ACT
E questo è già diciamo colpo d'occhio ci fa pensarci vacci tu giustifica il fatto che questa politica sia più selettiva per i cattivoni mentre queste più selettiva per gli anioni più cariche negative maggiori affinità per i campioni passano meglio entrano me
Andando anche a vedere sulla sequenza facendo il paragone di sequenza abbiamo visto la cosa ancora più interessante in particolare durante l'evoluzione quando si è è avvenuta successivamente alla duplicazione di questi geni
Praticamente in alcune posizioni
Il il tende lisina che erano presenti nel Pd alcuno la pietra forma sono state sostituite con dei dalmati quindi proprio in punti ben precisi delle cariche positive state sostituite da cariche
Negative allora abbiamo pensato di fare degli esperimenti di mutagenesi sito specifica e andare a ripristinare nel Didac due
Degnissime che diciamo la natura corso devoluzione aveva cambiato questo interessante anche per capire
Il ruolo di determinati amminoacidi determinate parte della struttura dovete sempre dobbiamo tener conto del fatto che questa proteina non è non si riesce a cristallizzare non è mai stata questa bizzarra quindi
Non si hanno informazioni strutturali dirette per cui bisogna un po'diciamo arrampicarsi sugli specchi per ottenere dell'informazione
E in effetti facendo mutagenesi sito specifica in particolare di questi due brutta macchia lisina
Ieri intanto viene quasi completamente ripristinata la la selettività per
I gli anioni diciamo sia una forte diminuzione ma quello che ancora vitale stante che non è viene completamente ripresa di pre
Fornite nuovamente quella proprietà che abbia chiamato dipendenza dal montaggio a questa follia di tipo due quasi finito è finito
E e questo è giustificato e giustificabile anche della posizione che nei modelli più recenti gli abbiamo hanno questi due brutta Mati riveduta macchine che si trovano proprio in punti critici all'imbocco di questi canali
Questo lavoro è stato già pubblicato appunto in collaborazione con gruppo tedesco in un gruppo di Bologna per il moderni
Stiamo facendo lo stesso tipo di lavoro per gli altri due geni gli abbiamo appunto espressi in vitro stiamo facendo degli studi
Di tipo funzionale di Studer istruiti proporzionale sembra che di questi altri due soltanto uno sarebbe in grado di formare canale adesso non entro nel dettaglio di questa figura ed infine abbiamo ormai appena fine luglio ottenuto gli anticorpi dunque inizieremo anche un'analisi immunologica sulla sull'insetto
Infine voglio ringraziare tutti quanti quelli che hanno collaborato e sono fondamentalmente tutti ragazzi di di Catania anche sono stati gli diciamo
Venuti su da quando io sono mi sono trasferito qui a Catania e poi un un cenno a un ultimo arrivo grazie
Grazie per l'interessante presentazione che aperta alle domande
Questi questi geni Paul che codificano proteine porre laica bene queste sono effettivamente espresse in Drosophila oppure se si avviene queste riferimento a un evento biologico fisiologico di qualche
Diciamo che questa è proprio l'interrogativo che noi ci stiamo ci vogliamo porre da un punto di vista abbiamo fatto l'esperimento intanto per vedere l'espressione degli RNA messaggi
Ieri mentre per il diciamo ci il primo quello di cui ho mostrato più immagini
Sappiamo che ha espresso in tutti i tessuti almeno all'RNA messaggero espresso in tutti i tessuti nel nei vari stadi di sviluppo
Per le altre per gli altri due RNA messaggeri invece sembra che ci sia una specificità tissutale in un solo tessuto sembra che soltanto nei testicoli
Un tessuto in cui ci sono molte cose interessanti tra l'altro sono collegate proprio questa proteina naturalmente questi sono informazioni a livello di trascritti ed imparzialità di proteine noi pensiamo di ottenerle grazie agli anticorpi che al proprio per questo abbiamo preparato
Posso chiedere una cosa
Avete provato a fare nel controllo se l'espressione pare delle PCR specifica del tipici alle specifiche per vedere se è spesso il senso anche quanti senso
No in effetti latitanza non abbiamo provato
Ci sono una serie di ieri si per sapere se effettivamente ori vestito
Brancoli no
E saluto ed amante abbastanza vaste dunque si sa dei mutanti mutanti
Esisteva un mutante in realtà non sono proprio dei mutanti sono delle
Dei ceppi in cui attraverso un traspose Sone
C'è un alla e per i di aventi tra spesso ventitré di trasposizione che viene conservata a Berkley in cui c'è effettivamente soltanto nella prima originale però c'è inserito un trasposoni è una cosa che è stata studiata da un gruppo di genetisti in particolare
Con cui abbiamo collaborato e in affetti
L'inserzione del traspose Sone nella Polina uno è un evento letale cioè far sì che la mosca non si sviluppi oltre un certo livello oltre quel livello in cui ci sono ancora gli venne a Messaggerie provengono dalla madre
Per quanto riguarda la seconda domanda anche lì c'è
Si sa che la collina può andare anche membrana plasmatica anche se in quantità molto più piccola della purina il Corina di quel di quella che vanno in ogni nella membrana mitocondriale Sterna è un argomento apparentemente poco attorno al nostro Dosso perché la cosa inattesa però c'è ormai già un molta letteratura anche l'abbiamo prodotto dei lavori che ci danno ma evidenzia in questo senso
E però diciamo si tratterebbe di fare un'altra se vuole poi viene posso raccontare ma in effetti ci sono delle evidenze abbastanza forti mole di abbia chimiche
Sia libero di biologia cellulare è stato visto proprio il il target il trasferimento di un ci sarebbe uno spray sia alternativo per cui si crea una cosiddetto PLI ridacchia cioè un Vidach con un
Sequenza di indirizza mento alla membrana plasmatica che passa attraverso il Golgi però diciamo è un argomento veramente molto recente su cui c'è ancora molta discussione
Il tutto
Per rapito grazie con pronti per andare avanti passo
Parola la Prussia insomma
Transilvania
Rossi
E tra le attese effettivamente anche un pesce Marche distratti Display chicas del feto trasporti reggini rimanesse mechanical ma faccia Caratese scendo delle Santin quando Display sia che pazze
Sì in primo luogo volevo ringraziare il comitato scientifico organizzatore per la possibilità di presentare questi dati su questo modello Mourinho che abbiamo recentemente studiato a Pavia e stiamo tuttora studiando
Dunque il trasportatore
Lo spot del sul fatto della dispersi e di astronautica è un trasportatore ubiquitario
E la sua funzione è una ti porto sul fatto che loro e la sua funzione fondamentale per il passaggio del sol fatto per il trasporto del sul fatto all'interno della cellula gran parte della sol fatto infatti citoplasmatico proviene dallo spazio extracellulare
è una frazione minore proviene invece dal catabolismo delle minoranze di che contengono zolfo oppure anche da altri composti ironici
Il sul fatto viene attivato all'interno della cellula a Fosco adenosina Fosco sol fatto che il donatore universale di solfato per la solfatazione delle macromolecole e in particolare per la la sottrazione dei proteoglicani
Mutazioni a carico di questo trasportatore determinano una famiglia di contro displasia
Che sono in ordine di gravità crescente la displasia multipla epifisaria che ha una forma molto lieve di contro displasia la displasia via Strozzi perché invece una forma grave compatibile con la vita
E infine la te lo stese nelle sedi due la contro Genesi uno bis che invece sono forme letali alla nascita o durante l'età fetale
Ora pur essendo un trasportatore ubiquitario votazione a carico di questo trasportatore del generalmente determinano a manifestazioni cliniche a carico della cartilagine
Infatti una mutazioni a carico di questo trasportatore determinano una ridotto attenti verso il fatto extracellulare questo si traduce in un ridotto pull intracellulare verso il fatto
Questo ridotto pool determina una sintesi di proteoglicani sotto solforati porri proteoglicani sono delle macromolecole che sono presenti in tutti i tessuti tuttavia nella cartilagine nel presente una grossa quantità in aggiunta i proteoglicani della cartilagine sono molto grandi hanno un gran numero di catene tipi cosa mirabile cani catene che sono pesantemente solforate quindi molto quindi il ridotto pure intracellulare determina soprattutto a carico della cartilagine la sintesi di proteoglicani sotto solforati
Questa sintesi influenza poi la l'organizzazione dalla matrice la sua crescita e la sua stabilità il risultato finale sono alcune contro displasia ora tutti questi passaggi sono notti soltanto
In in modo molto grossolano visto che finora tutte le analisi soste sempre state condotte solo subito sia provenienti dai pazienti quindi per conoscerle nella in una maggior dettaglio
Necessario per forza mettere appunto modello Murino di queste malattie
Inoltre
Risulterebbe particolarmente utile lo studio di questo modello Morino anche per valutare il contributo in vivo del catabolismo atti gruppi chili di sostanze su di composti sul sito riduce all'interno della cellula in quanto se fosse possibile
Aumentarne il catabolismo ovviamente potrà Momentary il pool intracellulare di solfato quindi aumentare la solfatazione dei propri cani
E migliorare le condizioni dei pazienti ovviamente un trattamento farmacologico sarebbe possibile solo nei pazienti vivi quindi i pazienti affetti da displasia di astrofisica
Quindi è per questo che abbiamo bisogno di una modello animale di displasia di astrofisica
Quindi abbiamo bisogno di un topo di tipo no chi minaccia di introdurre una mutazione puntiforme nella nelle aziende Murino non tocco di tipo knock-out perché è uno cauta determina la perdita completa della funzionalità della proteina e quindi un fenotipo letale prima della nascita
Quindi la mutazione che abbiamo deciso di introdurre appunto questa ad Annina tre otto sei Ballina in quanto questo è un paziente omozigote per questa mutazione ha le caratteristiche tipiche della displasia di astrofisica cioè a bassa statura ha il palato piatto a una classica deformità tipica da dispositivi astrofisica della della vecchia sterno e poi il
La classica deformità del pollice della mano e del piede che va sotto il nome di polizia dell'autostoppista
Questo invece il è il topino omozigote appunto per la votazione la mina tra otto sei pallina questo è una UAL type una all'età di due mesi
Questo è grosso modo il riassunto dei dati clinici nel poster non mi soffermo più di tanto nel posteriore ci sono i dati se volete consultarle
Ha comunque abbiamo risulterà abbiamo trovato una ridotta crescita infatti lo vedete anche dalla foto i movimenti di questi topini sono piuttosto ridotti di presentano contratture hanno in Morse inverso
Hanno una cifosi toracica come potete vedere molto severa
Presentano displasia dell'anca e la mortalità piuttosto elevate circa il cinquanta per cento nei primi tre settimane di vita
Abbiamo condotto alcune analisi istologiche queste l'epifisi dall'attività a diverse età vedete che aveva una settimana
Ha retto talmente cartilaginea tuttavia vedete che a due settimane nel quale dai il secondo centro di ossificazione abbia informato
Questo è tutto osso questa la la la cartilagine articolare qui sotto abbiamo la cartilagine di accrescimento mentre invece vedete che nella topino mutato il secondo centro di significazione lo sviluppo del secondo centro che se citazione appena all'inizio
Riguardo alla piastra di crescita abbiamo visto che le diverse zone della piastra di crescita erano ben sviluppate tuttavia a due mesi di vita
Alla piastra di crescita questa linea netta blu a nell'UAL type ma vedete che nella topo mutato è molto più irregolare addirittura in alcuni casi completamente interrotta confusione
Della dell'osso di effigiato io con la metafisico
Questo potrebbe spiegare il fatto della ridotta crescita di questi topini
Abbiamo condotto anche a un'ultima cosa i topi presentano anche osteoporosi infatti vedete che le trabecole ossee nello Altai possono Brenna sviluppate mentre invece qui a sono molto degenerate
Quindi questo è riassunto dei dati istologici cambi strutturali della cartilagine Cisaria che della piastra di crescita un ritardo nella formazione del secondo centro di ossificazione e una osteoporosi abbiamo condotto anche alcuni studi Dio chimici questo è un assaggio di attente dal sol fatto per valutare l'attività residua dal trasportatore compiuto appunto sui condrociti vedete che i topini mutati il l'attività residue molto molto bassa rispetto ovviamente ai UAL type o agli eterozigoti
Primo compiuto la stessa analisi anche sui fibroblasti nella stessa situazione
E questi sono esattamente i risultati che si ottengono quando andiamo a ad analizzare a compiere un esperimento di attende solfato nel nei fibroblasti una i condrociti dei pazienti
Abbiamo compiuto visto che avevamo il topino anche la stessa analisi sugli osteoblasti e anche la gli osteoblasti abbiamo ottenuto lo stesso risultato una attenti molto molto rito otto
Primo coi voluto vedere anche il grado di solfatazione dei proteoglicani in tratti su tutti primo luogo ovviamente la cartilagine abbiamo voluto studiare anche l'osso e la cute e l'abbiamo studiata diverse età dalla nascita a a due mesi il grado di solfatazione dei proteoglicani è stato misurato in base alla percentuale
Di distaccare de non solfato presente appunto nelle catene degli cosa Mino Bleu cani rispetto ai distaccare di totale cioè di staccare di non solfati e sul fatto
In poche parole bassi livelli percentuale di disaccaride non sul fatto significa che i proteoglicani sono molto solforati ed è il caso dei controlli Petri invece levati livelli di disaccaride non solfato stanno ad indicare che i proteoglicani sono sotto solforati ed è il caso appunto dei top di multati
Potete osservare che anche nei topi mutati c'è un incremento della solfatazione del proteoglicani anche se non si raggiungono mai valori paragonabili al controllo
Abbiamo compiuto la la stessa analisi anche sull'osso in pratica l'abbiam preso la diafisi del femore
Come vedete anche in questo caso i proteoglicani sono leggermente sotto solforati
Rispetto al normale purtroppo non abbiamo dati riguardo all'osso alla nascita perché la quantità di osso disponibile a molto scarse e quindi non era possibile compiere l'analisi abbiamo controllato anche la madre la solfatazione proteoglicani dalla cute come potete vedere nella cute la solfatazione del tutto normale parte in accordo col fatto che
Sia nel topo sia nei pazienti non ci sono alterazione a carico della cute
Quindi in conclusione questi sono ieri è il quattro riassuntivo dei dati biochimici abbiamo riscontrato un ridotto alte del sul fatto se ne contro i siti che nei fibroblasti Cagliostro Plastic abbiamo valuta abbiamo riscontrato una sotto sul formazione dei proteoglicani dalla cartilagine
Sì alla nascita sia anche alle alle tante fino all'età di due mesi anche se abbiamo in coro abbiamo riscontrato un aumento della loro solfatazione
Qui possiamo fare solo alcune ipotesi dal motivo una diversa velocità di sintesi dei proteoglicani un diverso catabolismo del proteoglicani oppure l'attivazione di altre vie di recupero del sul fatto che sono più o meno attive Adigrat setta
Infine a ovviamente impropriamente all'osso erano solo lievemente sotto solforati e quali dalla cute del tutto normale
Quindi in conclusione i dati clinici istologici biochimici confermano appunto che il fenotipo a paragonabile a quello della displasia di estrosità
Quali sono i progetti futuri ecco le ore assunti qua vorrei soffermarmi una
Timo sul primo
Cioè lo studio delle di alternative di recupero del sol fatto perché almeno nella breve periodo potrebbero avere una rilevanza per i pazienti
Quindi a questo proposito abbiamo voluto vedere se il a la via chiediamo dimostrato quella del catabolismo di cisteina e di altri gruppi ti eolici è attiva anche nella cartilagine o meno
Infatti l'attività di questa via è diverso a seconda dei tipi cellulari
Quindi a questo proposito abbiamo preso dei frammenti di cartilagine dei topini leviamo marcati con glucosammina Trezzi attacca una cisteina marcata con sorso trentacinque
In questo modo abbiamo marcato i chili cosa Mino biecamente i proteoglicani sia con il trizio proveniente dalla glucosammina sia con il sul fatto proveniente dal catabolismo della cisteina e come potete vedere
A questa via è attiva appunto anche nella cartilagine
In questo rapporto zolfo trizio erto potete vedere circa quattro volte superiore nella malato rispetto al qualcosa e quindi quello che vorremmo fare nell'immediato e quello di approvare appunto ad iniettare dei derivati della cisteina in modo da vedere nel topino in modo da vedere se è possibile incrementare la solfatazione
E per finire volevo ringraziare tutte le persone che hanno collaborato questo lavoro nella gruppo mio gruppo di Pavia di cui faccio parte diretto dal professor certa
Poi come il gruppo di Roma per quanto riguarda le troppo razione delle cellule staminali e la produzione delle chimere sono due fasi appunto della produzione dal tappo notti in e Superti furgoni guardo alla discussione sulla mutazione da inserire e anche l'interpretazione dei dati clinici e sia nel topo sia nei pazienti grazie
Grazie ci sono domande
Sì no una domanda banale che forse avete fatto
Coltivando le cellule in vitro avete anche coltivato c'era un invito pay pari oppure foto su un'analisi no prevedeva semplicemente ha detto ci potrebbero esservi differenze nelle proteine della ICM avete fatto collagene i
Sono prima erano fluorescenze no agli analisti sono state fatte l'Asi Day proteoglicani è stata fatta a sue schianti cutanei precisamente sulla cartilagine della testa del femore e le analista del fatto in HPLC
Naldi succede lunedì immunofluorescenza per vedere la distribuzione delle diverso Protti nome questo no avete non ancora no no
Certo è vana
E
E
Complimenti Antonio è molto bello
Anzi mi chiedevo ma questo in capacità di trasporto verso il fatto non si traduce in questi pazienti anche in un tecnici tetti altri con gruppi etiopici deficit di aminoacidi solforati cose di questo tipo
Perché mi chiedo se effettivamente è una prospettiva quella di fornire una
Supporto di dividi sostanza di questo tipo cioè ce la fa
Il paziente a sintetizzare gruppetti eolici anche in carenza di trasportatore del super se queste questi dati cioè non abbiamo mai valutato anche altolà solfatazione di altre proteine o appunto la presenza di
Tutta azione ecco tutti questi altri che composti dai nostri idea era quella di a un di somministrare dei derivati della cisteina
Che sono poco tossici in modo da forzare la cellula pacata Blizzard come sostanzialmente
Ovviamente non pensiamo di somministrargli cisteina perché uno delle minoranze di più insolubili presente nella cellula importi in quantità molto basse proprio Kakà
Attende facilmente precipitare quindi l'idea ovviamente di usare la la NCT cisteina che a si conosce molto bene la la bassissima tossicità è penso sia
Importante darne una una notevole quantità tenuto conto che alla cartilagine poco vascolarizzata e quindi sicuramente c'è da ce lo spingeranno in quantità molto elevate comunque abbiamo dei dati in vitro che dimostrano che la nei siti cisteina può essere utilizzato appunto in questa via quindi
Dovrà provare in vivo ecco
Cutting sotto il sole cocente passione allora andiamo anche con Laura Barberis da Torino
Che ci parlerà di tredici K gamma nessuno
Servono
Allora intanto c'è da dire che la Pietri careers gamma è l'unico elemento noto della vastissima famiglia delle fosfati di non esserlo tre chinarsi
Caratteristica di Venere attivata soltanto in seguito all'attivazione di accettereste che domini transmembrana collegati a Prati nel PCI
Le subunità beta gamma delle Aprutina G sono in grado di reclutare la pièce di Cunningham a livello della membrana plasmatica dove queste attiva Pietri pescando come tutte le altre Fossati Pino Sottano tre Tinazzi ha poi un'attività chinarsi Caprotti è che la caratterizza che la porta fosforilare il Fossati Lino di inositolo difosfato impostati inositolo trifosfato
Questo evento causa l'attivazione di un basso numero di segnali orale tra cui l'attivazione di molecole come picche via Capatti che presentano il dominio Plastino Morigi o il patto di della famiglia delle macchine anzi
Dapprima abbiamo generato topi completamente knock-out e quindi privi di Pietri Cangas gamma questa molecola è espressa soprattutto a livello Luco cita Mario ed effettivamente il tenuti poi osservato soprattutto in queste cellule
Dove si vede che i macrofagi neutrofili dei topi privi di pietre canestri Anna sono incapace o comunque presenta una ridotta capacità di rispondere lo stimolo che mo'tattico e di indurre quindi una risposta una quarta risposta infiammatoria
C'è da dire che però che Pietri Canesi gamma espressa anche a livello cardiaco
Dove il suo ruolo è abbastanza discusso in quanto si è visto che modula la risposta contrattile ma anche coinvolta nella patogenesi dell'ipertrofia cardiaca
Nel quale sono espresse però altri isoforme di Pietri cane siccome l'altra è la verità
Entrambi è caratterizzate dal ruolo di regolare l'ipertrofia cardiaca mediante la ripartizione della taglia nel cuore
Per capire quali fossero effettivo di questa molecola nel quale abbiamo elaborato un modello di sovraccarico pressoria cronico
Che abbiamo ottenuto mediante una costrizione chirurgica dell'aorta
Effettuata alla biforcazione delle due carotidi all'interno delle due tratti di sono stati posti due sondini per misurare la differenza di pressione e quindi monitorare i topi durante tutto il il tempo in cui veniva mantenuto questo sovraccarico pressorio questo tempo è di sette giorni
Al termine in questi sette giorni topi venivano sacrificati e il quale di questi tappi veniva paralizzato queste sono analisi ecocardiografica che rivelano come i sette giorni di sovraccarico pressorio che chiameremo TAC in futuro
Sul quale ugual Tahiti induce un ispessimento della membrana del ventricolo sinistro con riduzione del volume del venti e del lume del ventricolo sinistro ma nessuna alterazione a livello della contrattilità cardiaca
Al contrario nel topo privo di pietà e carità ma noi abbiamo una forte dilatazione del ventricolo sinistro con una riduzione dello spessore delle pareti del ventricolo è una drammatica caduta della contrattilità
Sia
Allora scusate anche i quali macroscopicamente si presentano molto diverso infatti il quale ugual tanta al termine di questa costrizione
Dell'aorta sembra macroscopicamente normale mentre il cuore derivata dal topo privo di pietà il tam presenta delle aree bianche abbiamo analizzato questi Quarin Istologia che si vede come il quale ugual talché apparentemente era normale in realtà sia fibre attizzato cioè presenti estese aree di fibrosi peraltro attese
Visto che stiamo inducendo sovraccarico pressorio cronico all'interno c'entra Mezzate tra i capi omicidi mentre nel cuore non cult non amiamo tanto aree di fibrosi diffusa che sembra mancare
Mandiamo in corrispondenza di quegli spazi bianchi che vedevamo a livello macroscopico delle aree di necrosi quindi di totale assenza del cambio mi eccitano
Per cercare di definire tavola dipietrista e scampati da questi esperimenti non era ha fatto no fatto chiaro abbiamo generato un altro intanto è un altro topo mutante
Che invece di essere completamente privo di Pietri tendiamo a presentarla ti Entrecanales gamma multata c'è soltanto priva dell'attività chi natica
Questo è stato sostenuto sostituendo una lisina importante per attività chinarsi cariche Triveneto gamma con una regina
Questa diapositiva e solo per mostrargli come effettivamente i topi
Privi del dominio chinato di pianificare il Gamma siano si comportino effettivamente come tali quindi non siamo in grado di attivare le molecole a valle di Pietri Canis gamma né di rispondere correttamente uno stimolo che molta attico di tipo migratorio
Al contrario però quello che ci ha sorpreso e che nel cuore questi topi privi solo dell'attività di Chieti Canesi Anna
Presentano dopo costrizione dell'aorta un fenotipo che è simile a quello osservato di qualità e per completamente diverso quello visto nei topi privi di Pietri cancan
E in questi topi manca la canta di contrattilità conservavamo Nino cauta questo è molto importante perché ci ha detto come l'attività chinati cariche Tricase gamma non sia assolutamente importante per la regolazione della contrattilità cardiaca
Se poniamo analizzare le Istologia e di questi cuori notiamo come venga a mancare anche la fibrosi tessutali che invece si osservavano intoppi qualità e tre e questo è sì col Parma che la fibrosi e dipendente dal patto e delle macchinari e un qualcosa di strettamente legate all'attività chi Nasica di Pietri cane Scalmani
Per poi definire nel dettaglio questa via abbiamo indagato i livelli di MP ciclico da quel momento che in letteratura ed è scritto che il danno cardiaco molto spesso si porta in insieme in correlazione con un aumento delle mettici Crippa livello dei cardini Citi
Abbiamo quindi misurato l'MP ciclico nei topi dei tre genotipi guai type privi di più etica del Gamma esperimenti la forma Caner tetti Pietri Cunningham prima e dopo la TAC e notiamo che i topi privi di Pietri Canis gamma no stanno già un forte aumento telemetri ciclico significativo rispetto al guai Taipei al topo privo dell'attività Pia altri di chianche di Pietri Cunningham ma questo prima dell'induzione della costrizione dell'aorta
Quando prendiamo a applicare questo sovraccarico pressorio l'aumento dell'MP ciclico
E ancora più drammatico questo esperimento è confermato dall'analisi della fosforilazione del Foscolo Albano a che è appunto querelata livelli di MP ciclico nella cellula
Per vedere se questi fenotipi osservati a livello dei topi privi di Pietri cane sgamato tessera essere collegati davvero il responsabile potesse essere considerate potesse essere considerato l'MP ciclico
Abbiamo inibito la abbassato la concentrazione intra Cardin citare ad elementi cito usando il propano Rolo che è un agonista beta due adrenergico e quindi blocca la produzione di AMP ciclico e come possiamo osservare i topi privi di Petri canestri Anna che in seguito a costruzione era morta avevano elevati livelli di MP ciclico
Se trattati compro pannolone diminuiscono le concentrazioni di MP ciclico a livelli paragonabili a quelli dell'UE il Tarp
Anche questi topi trattati contro pannoloni presentano delle analisi ecocardiografica che sono simili a quelle dei guai Tietê e di nuovo le analisi istologiche di questi tappi trattati contro parlano loro mostrano come non si vengono a formare queste aree di necrosi
Possiamo quindi concludere che davvero la MP ciclico responsabile del seno tipo osservato qui abbiamo fatto tutta una serie di esperimenti per cercare di capire cosa tra Pietri Cunningham e l'Anp ciclico andasse influenzare livelli di Mpc qual è il cardine cita poteva esserci un difetto a livello delle tortine Citti meriti di tipo inibitorio
Che quindi non erano più in grado di bloccare compensare i livelli di MP citi costruzione di ambiti ciclico ogni sette a livello delle fosfodiesterasi che non vedrà davano problemi PC che una volta prodotto
Esperimenti che non vi mostro ci hanno mostrato che sono proprio le fosfodiesterasi a essere alterata in questo sistema
Infatti se immuno precipitiamo Pietri Karel camma da estratti di qua reparto ha più qualità e che andiamo a misurare l'attività Fusco di statica non possiamo dettare una forte attività fosfodiesterasi cade il tempo che viene completamente inibita dall'uso di inibitori non selettivi delle fosfodiesterasi come l'IBM X esistono però sette famiglie di fosfodiesterasi
Per definire quale fosse responsabile del nostro sistema abbiamo testato e l'invito a riferire attivi sfortunatamente non esistano inibitori selettivi tutte queste famiglie ma siamo stati fortunati in quanto meno Simone un inibitore del fosfati strati di classe tre
E in grado di inibire l'attività fosfodiesterasi cani gli estratti di muro prestiti figli distratti muro per citati perché criteri gamma a livelli compare la paragonabili a quelli ottenuti con un inibitore non selettivo IBM X
Di nuovo la fosfodiesterasi tre compone Hassler composta al suo interno da due elementi posto di strati tre a entrambi entrambi come vedete a questi plotter espressi a livello cardiaco
Noi però il muro precipitando Pietri cane Scanno abbiamo visto che soltanto ora fosfodiesterasi Trebbi con precipitazioni Pietri cascame quindi possiamo concludere che la fosfodiesterasi Trebbi implicata in questo sistema
Per confermare questi dati abbiamo fatto l'esperimento al contrario c'abbiamo un muro precipitato dagli estratti dei tre genotipi la fosfodiesterasi Trebbi e misurato attività fosfodiesterasi Ca'
Di nuovo immuno precipitando costose terapie strati trepida estratti quarta e poi da estratti privi del dominio chinasi che Di Pietro Italia scarna perdiamo la normale attività fosfodiesterasi Ca'
Mentre sembrino precipitiamo fosfodiesterasi tre viveri estratti privi di Pietri Canesi gamma non dette Thiam
Attività fosfodiesterasi Ca'e questo ci confermo palchetti Cunningham sia cruciale per la regolazione della fosfodiesterasi tre bit abbiamo provato a recuperare questo deficit somministrando una proteina ricombinanti rapiti cascame ricombinante a questi estratti derivati dei topi privi di Pietri Canis gamma per cui se noi aggiungiamo questa proteina ricombinante agli estratti di Pietri tedesca ma prima di immuno precipitare con la sosta di strati tempi e poi misuriamo l'attività fosfodiesterasi ITA otteniamo un normale livello di attività vera fosfodiesterasi
Se al contrario noi aggiungiamo le propina ricombinante soltanto al termine degli immuno precipitazione frapposto disperati tre bit quindi in un sistema in cui abbiamo Giannino precipitato fosfodiesterasi tre viene Moriconi più con essa
Po'precipitano non siamo in grado di recuperare l'attività fosfodiesterasi Ca'questo è molto importante perché ci dice che Pietri cane scatta un elemento cruciale per l'attività della fosfodiesterasi tre prima non è l'unico è necessario per la formazione di un compenso che può comprendere non sappiamo quali e quante altre molecole
Qui è soltanto per riassumere quale ruolo di Pietri caricammo a livello del quale una volta che noi andiamo a somministrare un sovraccarico pressoria Chronicle sovraccarico presso elettronico attiva l'atletica in scala ma questa qui in un modo dipendente dalla sua attività chi Nasica attiva al patto di ma dei macchinari vigliacca tattili e quindi induce un amento della fibrosi e dell'ipertrofia cardiaca
Una via in un modo invece che è indipendente dalla sua attività chi Nasica ma dipendente dalla sua localizzazione membrana
Pietri Camassa Orsa e forma un complesso proposto di strati tre B l'attiva questa riduce i livelli di MP ciclico e aumenta la contrattilità ripristinando i valori Condi contrattilità normale dopo il danno cardiaco
Solo un minuto per ringraziare tutte le persone che hanno contribuito a questo progetto e son veramente molte primo tra tutti Errico Patrucco che ha diviso con me ogni singolo esperimento quindi gioie e dolori il mio supervisore Emilio io sento articolari professa riferendo al Trude Lorenzo si vengo grazie
Grazie mille anche domani sì
Basterà
Ecco chiederei se in questi topi knockout per pietre Caithness gamma hanno
Qualche fenotipo relativo ad altri componenti del del dieci e porta l'ipertrofia cardiaca intendo diretti poca al Signore nel fatto e infine avete visto se per caso in questa situazione c'è un un diminuzione per esempio delle attività di ciottoli prescrizionali che son coinvolti nell'espressione di geni cardiaci presso MEF dove per esempio
Allora a livello cardiaco i topi knockout colpiti calcano non presentano nessun difetto se non i modelli patologici introdotti e non inducono altre non non sembra alterare altre vie per quanto riguarda insiemi indotti non abbiamo mai guardato adesso in realtà vorremmo e ci stiamo attrezzando in questo senso però non violenza non credente
E
Che sta male e quindi
Recuperiamo forse qualche minuta e andiamo all'ultima presentazione
Quindi Ragusa da Catania
Ci parla questa identificazione dei nuovi membri delle la famiglia delle catene mai niente tra utenti
Grazie buonasera a tutti
Violenze volevo ricordare che questo lavoro che è il frutto di un di una collaborazione che ormai da diversi anni esiste tra il Dipartimento di Scienze biomediche gruppo del professor Michele Borrello il Dipartimento di Matematica Informatica il gruppo del professor lasciato fare uso qui diciamo al trovato gruppo completo
Come ben noto l'inizio della trascrizione uno dei punti di controllo più importanti e regolati della complessa fatto e che connette il genotipo e fenotipo interna di questo meccanismo Pdp svolge un ruolo cruciale CPP acronimo che sta per fare la boxe vanno introdotte in questa pratica importante non solo perché è coinvolta nella formazione dei complessi di tre inizio delle tre classi di geni degli ulteriori ma anche perché la ritroviamo né McKinney macchinari trascrizione di tutti i regni venti croniche escussione dei procarioti
è ben noto il meccanismo azione di questa proteina
Ti BP riconosce legalità da boxe attraverso un contatto con solco minore del DNA quindi forma un complesso stabile riducendo la distorsione dell'Emilia e prenda contatto con i coatti dei coltivatori tasso di BP estesa del fatto
Quindi perdendo contatto con i vari fattore di trascrizione quindi infine permettendo le rane polimerasi le grazie al DNA
Diciamo è riassunto di quello che stati detti quindi riconosce la chiesa la boxe e permetti legame le Renna polimerasi attraverso l'interazione con i GTS
Un'altra cosa importante di questa proteina è che il il suo corto Meini accordo man è costituito dal
Sì alta la boxe vanno in programma che è delle Regioni e pentono che interagiscono con i fattori di trascrizione presenta un eccezionale grado di conservazione dall'uomo fino all'Artico batterica e suggerendo sia uno stretto rapporto struttura funzione di questa Rosina se l'altra parte che la funzione di questa pratica si sia stabilita molto presto nel corso dell'evoluzione e che già adibiti fosse presente l'antenato comune di eucariotiche arche
Ora il nostro gruppo già ormai da diversi anni si occupa della genomica dei fattori di trascrizione negli anni novanta
Attraverso tecniche di Fischer istruire gli di cellulari aveva identificato il getti di di il genoma umano sul cromosoma se cute se se i cui due sette dato poi confermato anche successivamente da altri
Da altri gruppi è il modello che prevedeva c'è un l'unicità di di BP come unico fatto in grado di
Lega è stata box per prendere contatto con i fattori di trascrizione mantenne la sua validità nonostante sempre in quegli anni venne scoperta in Drosophila un omologo Icbpi TRF
Il BP relate X-Factor questo gene scoperto esclusivamente in Drosophila venire spesso soltanto negli embrioni nel sistema nervoso adulto nelle cellule germinali maschili contro l'espressione di uno specifico pool di geni ed è in grado sia di legare vista la boxe ma anche quella di riconoscere altre sequenze consenso qualche anno più tardi perché scoperto un secondo muro cui di BP stavolta in tutti Mezzoiuso compresso questo qua a differenza delle dichiarazioni Drosophila mostra un'espressione ubiquitaria
Anche questo contro l'espressione di uno specifico pur di geni ma non in grado di legalità da box
Quindi a questo punto
Si voleva un problema ma allora
Esisteva unico ti BP in grado di riconoscere tutte le varianti di promotore di legare i fattori di trascrizione nei vari nelle varie ai tipi cellulari oppure esistono varianti di BP TTP multipli con differenti che
Capacità funzionali nei diversi tipi cellulari che certamente un problema
Interessante ma interessante per chi si occupa di queste cose
E adesso che siamo in piena era così nomi che abbiamo voluto in qualche modo di considerare pro stavolta avvalendoci della maggiore sensibilità degli strumenti di biologia computazionale
Idealmente il nostro approccio si può dividere in quattro Stati
Come prima cosa under ricercare entra nel gioco mano proteine strutturalmente simili atti BPM per far questo abbia utilizzato come sonda computazionale fissata box vanno indumenti prodotto da ogni dove in che così costituito da due ripetizioni dirette imperfette
Che per formula ricordo medico la stucco al tipica caratteristica struttura Sellam che cosa abbiamo trovato
Ovviamente entra il giovane abbiamo ritrovato ti BP che tirasse dura sul cromosoma rispettivamente sul cromosoma secondo sette sei Couto tre ma il risultato nuovo e inatteso
è stato poi di avere trovato una sequenza allora sconosciuta su un clone Buckler possono quattordici sequenza che poi noi faremo chiamato Tpg ti BP para locus Jim
Abbiamo quindi ripetuto la stesso tipo di analisi su tutti i database genomi ci sino a oggi disponibili
Cosa abbiamo trovato demente oltre attivi pietire riviste abbiamo trovato lungo tutta la linea dei vertebrati omologhi di PG
Ovviamente non è stata estesa anche a genomi di organismi inferiori vertebrati ma non abbiamo trovato nulla quindi questo suggeriva che questo genere fosse vertebrato specifico ed ha cercato
Di ricostruire la struttura genomica di questo che fino adesso fine fino in questione per un ipotetico genera che cosa abbiamo trovato e ho trovato che la NATO mia molecolari di Tpg
Ester ordinamenti simile a quella di tibi pitta di Pramaggiore di quella di dire se due parti BP infatti
I cinque saloni che enti BP
Scopo
I cinque sono ingenti PPI costituiscono il cordone in si ritrova in maniera come dimensione assolutamente identica in Tpg
Facendo se stai zitto tutti tipi girava identificati cos'abbiamo la stessa cosa cioè quegli esoni Chienti BP
Così devo ricordarmene in tutti Tpg dall'uomo
Sino al fu sono con sé perfettamente conservati come dimensioni Renault coi condotto questo tipo di analisi anche
Sulle strutture Gino Michele vari tipi di pieno Enichem i sette che stessa cosa cioè che l'Inter subphylum dei vertebrati gli esoni quei famosi cinque saliti BP sono sempre perfettamente conservati
Potrei far notare che dato che la collezione di sequenze di strutture giovedì in banca dati nella completa abbiamo completata tra il suo approccio in silicone
Lo stesso si può dire anche perché le sedute anche in questo caso e gli esoni che costituiscono il cordone in sono perfettamente conservati all'interno del gruppo dei vertebrati anche in questo caso abbiamo in maniera e in maniera più computazionale
Completato la collezione
E a questo punto abbiamo e valutato l'omologia delle sequenze non identificate inoltre vorrei sotto Ina e l'uso dell'Antitrust al due che un programma ideato messa a punto
Implementato dal nostro gruppo
Stalin vi parlerà domani il dottor Pulvirenti ma abbiamo salvato che se paragonate paragonando chi BP e tutti i tipi generalizzati
Siete una straordinaria molo gelido della porzione tre primo forse il primo che ricordo corrisponde all'accordo ma ndt BP certamente la topologia proprio tra box ramingo mesi può apprezzare ancora di più se se se salviamo l'allineamento Pamina civico inoltre segno che dettagli possiamo vedere che quegli aminoacidi
Che enti BP prendono contatto diretto con inutilità la boxe in tutti Tpg sono conservati
Invece una cosa del genere non succede perché resta infatti che aria tirasse due non riconosciuta la boxe patto infatti anche o dall'altra cosa come invece la conservazione sia molto più scarsa di programmi o terminale in altre parole non vi è omologia allievo del mio terminale tratti di P e Tpg e anche paragonando i Tpg tra di loro l'omogeneità è molto scarsa l'unica eccezione di quel sta porzione
Quindi questo qua da un lato suggerisce un a mio terminale specie specifico mentre invece l'eccezionale conservazione del capo sterminarli che più sembra di Tora quasi identico rispetta coliti BP
Suggerisce fortemente che questa proteina Possa riconoscere legalizzata box ma anche prendere contatto con i fattori di trascrizione così come fatti BP
Questo grafico mostriamo la velocità evolutiva dei cordone in dei tre membri della famiglia ti BP è stata qualità Aprutina modello tibia Pertile
Tre sono stati sommerà anziché di Saccà quattro che sa rispettivamente una proteina non conservata
Cioè sono stati sovrastima proviene con grado medio di conservazione vi sarà calcolata Prodi non per me notoriamente molto conservata lo potete vedere la velocità evolutiva dei tre membri le fogne tipiche molto bassa indice di una forte pressione selettiva nel tempo
Quindi abbia cercato di ricostruire filogenesi molecolare di questa famiglia non potete vedere Tpg appare dal punto di vista che dedicò molto strettamente correlato
Atti BP rispetto a quando invece non faccia chi era seduto
Quindi per valutare l'omologia ad un livello strutturale superiore abbiamo che seguire la perizia le strutture secondarie
Questo vedere cui il la struttura Alfa Beta che caratterizza il tempo sia Mianiti BPM costituito da dieci foglietti beta e quattro Alfa eliche
Si ripete in maniera assolutamente identica in tutti i tipi Gizio già neanche una volta
Quindi era molto forte che
Tpg si comporti
In apparenza meno Cometti BP
Ovviamente questo è stato solo un approccio insinuando dovevamo necessariamente confermare l'approccio invito quindi cosa abbiamo fatto abbiamo condotto una serie direttivi c'era nessun pure di Rna umani diversi tessuti questo qua c'è permesso da un lato di Pinti Figari solare tre siti di PG e quindi sequenziato in maniera tale da poter confermare la Rizza e geni avevamo fatto d'altra parte ci ha permesso di studiare che l'espressione di questo genere
O in questo pannello spettanze di quanto sia in questo pannello Tpg mostro espressione ubiquitario laddove non sia della banda
è stato messo in evidenza attraverso delle aste di PCR
Comunque l'espressione generalmente molto basse è abbastanza variabile da un tessuto all'altro la cosa che spicca mia particolare questo livello di espressione molto marcato a livello del testicolo quindi abbiamo condotto stesso tipo di esperimento anche Berti BP
Tipi invece le splendide viste senso molto più omogenee ma anche in questo caso nel testicolo
Presente una è un'espressione più marcata
Lo stesso si può dire per chi era F due
Ovviamente il questi questi dati confermo la digerite da dire tra tue inoltre e più volte riporta in letteratura che fattori di trascrizione mostrano nell'espressione più elevati di meno del testicolo
Quindi
Se nessuno è dicendo che la procinto Sivo ci ha permesso di identificare una sequenza altamente omologata a Bossi meriti DP lungo tutta ieri vertebrati
Quindi possiamo dire di aver trovato un nuovo molo guitti BP vertebrato specifico con un apparente
Capacità Tata Bai Ling
D'altra parte i i dati invito ci ha permesso di isolare et scritti di Tpg di analizzata differenti vede espressione quindi possiamo dire che la sequenza è un nuovo gene attualmente stiamo caratterizzando la porzione cinque primo TR
Di Tpg umano per poi passarlo sui del promotore
Inoltre stiamo anche realizzando i livelli di espressione la presenza di eventuali ed elezione delle azioni per Tpg tibi picchetti F due subito siedi neuroblastoma perché
Del nostro gruppo ha osservato che in questa forma di tumore in alcuni casi di sono implicati fattori descrizione generati
Che cosa possiamo dire sulla funzione di questo genere possiamo fare in effetti delle ipotesi forse Tpg potrebbe essere implicato in tutte quelle forme d'inizio della trascrizione indipendenti e ti BP
E ne esistono esempi letteratura oppure
Esperimenti condotti in un altro gruppo sembrano suggerire che questo
Questo gene proteina CNPC è implicata nel controllo all'espressione genica durante lo sviluppo embrionale
Comunque sotto questo punto di vista c'è ancora effetti parecchio lavoro da fare questa definito grazie
Grazie
No la domanda da fare dato che alla fine si è visto che i geni che hanno fatto a box canonici sono veramente venti per cento mi pare esotico
Allora è possibile che a differenza di Ittierre
Invece non riconoscere Tata box questa possa riconoscere famiglie diversificata bozza
Far caso ci sono categorie di geni interessanti da
Avete qualche idea
Effetti noi possiamo farci un'idea in base all'analisi strutturale che mi ha fatto in effetti come si è visto il caldo seminari dibattiti PG Ostuni in una omologia altissima perché BP
E che lascia suggerisce fortemente che questo gene si comporti come ti Bpce che riconosca il Tata box
Però
Sono soltanto ipotesi del secolo
Gli Stati Uniti opinabili dobbiamo segnerebbe
Continuare vedere
E se mi sa che le sta dopo Cristo esistono molte varianti quindi lo so se è possibile che bipiede riconosco alcune Tpg né dicono scaltro e che praticamente si lancia magari sta
Altre domande
No allora ringraziamo tutti gli speaker devo dire ma a parte merita la stessa era molto interessante comunque grazie
Non s'era grazie per avere rinunciato al caffè comunque per ST entrati rapidamente
Diamo inizio finiremo in tempo utile
Quello che ci aspetta era questa sera ma è noto a tutti che il primo oratore privilegiato del diritto
Circa trenta minuti mentre gli altri entro un quarto d'ora si dovrebbero contenere e quindi penso che ora avremo terminato in tempo utile
Resse riportate all'hotel e poi dove ci attende questa sera più oratore mio poi c'è ma il professor Balduini dell'Università di Pavia
Che ci parlerà del fattore di fondi le brande tra e della funzioni delle piastrine sapete che è un fattore coinvolto nella aggregazione piastrinica un processo molto importante
Nei processi di coagulazione ovvie
Prego grazie mi sento un po'in colpa per averli costretto nell'aula inteso che nel giardino a prendere un po'd'aria
Ma del cercherò di essere rapido e di non così
Arbitro
Per tutti ben sapete che le piastrine sono delle dei piccoli frammenti cellulari che derivano dai loro precursori che sono in carrier Citti e che rivestono un ruolo di assoluta primaria importanza nella processo delle mostre sì
E sono caratterizzate dalla capacità di rispondere in modo assolutamente eccezionale a tutta una serie di agonisti
Gli agonisti che possono sostanzialmente essere divisi in due grosse categorie Idi agonisti cosiddetti solubili cioè quelli che si tengono a trovare nel plasma in particolari
Situazioni quando questi degli Alcolisti vengono portati all'attivazione del questo il caso
E la trombina del trombo saranno della di Peter esempio che hanno loro specifici recettori che mettono in moto delle specifiche sequenze di segnalazione
Il secondo gruppo di agonisti quella rappresentato dagli agonisti legati alla superficie del sotto indotte cioè si tratta di agonisti quali hanno la capacità di venire a contatto con le piastrine
Tutte le volte che in seguito ad una lesione traumatica o patologica si viene a smascherare sotto indotte riuscirebbero a smascherare i componenti presenti nel sotto il Buttiglione
è il caso naturalmente degli recettori che vedete indicati qui sotto che sono recettori per il collagene per il fibrinogeno per il fattore di Bonvi le brande il fattore di continue branda è uno di questi recettori legati alla sotto indotte Elio
Ed è un nome forse il nome più antico nell'ambito dei meccanismi della funzionalità piastrinica sul quasi cent'anni che conosciamo il termine pontile branda quando appunto Pompili avranno aveva descritto una malattia emorragica senza capire bene ovviamente da che cosa dipendesse
Ed in effetti è solamente circa una ventina d'anni fa è stato chiarito che cos'è il fattore di tonsille branda
In questi venti anni direi che l'importanza di questo fattore andata gradatamente accrescendosi perché questo perché pur non essendo il più potente tra gli agonisti
Legati alla superficie del sotto indotte meglio è certamente quello che entra per primo in gioco nelle condizioni in cui l'emostasi si deve manifestare più frequentemente cioè nelle condizioni di alto flusso è nelle arteriole che è un esercito ed al pericolo nei capillari in cui illa fattore ricordi le branda determina il primo evento emostatico e senza l'intervento del fattore di compiere branda non può andare avanti del nostro sci e di qui il l'interesse che sta rivestendo questo
Particolare meccanismo di cui parleremo oggi proprio perché potrebbe essere il target per interventi terapeutici che come sapete in questo settore sono di grande di estremo interesse
I fattori convivevano dis come dicevamo è stato chiarito nella sua struttura è una dirigo proteina di duecentocinquanta chiedo da Alton
Nella sua struttura ci riconoscono tutta una serie di domeniche sono responsabili del legame a parecchi tipi di molecole ricordiamo solamente il fatto che il trattore di colpi le brande è in grado di legare il collagene fibrillare i e che in particolare in grado di legare la piastrina in particolare il recettore GT GP uno p cinque nove presente sulla membrana piastrinica
Normalmente fattore di compilo branda si trova sotto forma Multimedica quindi ha un peso molecolare da cinque schierata cinquecento a venti mila è prodotto dai mega Calyon Citi in quindi presente in circolo e ha prodotto dalle cellule endoteliali
Però voglio sottolineare che il trattore dei conti rileverà anche entra in gioco né l'emostasi essenzialmente il fattore di plasmatico il fattore plasmatico il quale si fa legare sotto endotelio che si si è espone in seguito dal ad una lesione arricchendo quindi di fatto la concentrazione del fattore di conti la branda
Che c'ha originariamente presente né sotto in dote spero di assegni spiegato bene
Il ruolo del pastore bidonville Olanda lo vedete indicata è quello di legare appunto complesso Brico proteico GP uno dei cinque no nove cinque della superficie presto piastrinica promuovendo l'adesione e l'attivazione ha un altro ruolo importante del quale non parleremo che quello di essere trasportatore del fattore ottavo
Per quanto riguarda il primo delle sue funzioni questore un'animazione diciamo di quello che succede ispettore dico Villagrande quello che
Depositando sì sulla superficie del sotto endotelio che ha perso la le cellule endoteliali riconosce il suo specifico recettore sulla superficie piastrinica
E lo riconosce come un legame debole un legame che non è in grado di fermare la piastrina ma in grado di rallentarne la corsa e di determinare il fenomeno del Rolling la piastrina sull'endotelio in seguito a questo rotolamento la piastrina va gradatamente incontro ad un meccanismo progressivo di attivazione che fa sì che si mettano in moto altri recettori ed esiti
Più Forche stabiliscono dei legami più forti ed esiti Chirico diciotto endotelio fino ad immobilizzare la piastrina che a questo punto sia attiva completamente va incontro al fenomeno di aggregazione dicevamo che il recettore sulla piastrina per il fattore di Brambilla volante è questo Complesso
Struttura che è costituita da cinque componenti proteiche
Che vanno sotto il nome di GP uno di Yalta e ce ne sono due coppie di questo G più dubbi alta due copie di GP uno di detta due corpi di GP nove e una sola copia di cibi cinque questo insieme forma
Una Complesso funzionalmente attivo come recettore
La cosa
Così che
Ha suscitato e sta suscitando molto interesse naturalmente la verifica di come fa questo recettore
Specifico per il fattore di non rilevare ad essere coinvolto nei meccanismi che abbiamo già detto ti adesione di attivazione piastrinica spaccio recettore
Che non è associato proteine g che non attività tiro centinaia circa che non va incontro a posto relazioni tirosina ciò nonostante noi sappiamo questo è ampiamente documentato che le canne del fattore ricordi le brande alla recettore determina attivazione da Fusco di pasticci attivazione da Fossoli pagina due
Riorganizzazione del citoscheletro Fosco relazioni tirosina di diverse proteine
Reazione di rilascio e aggregazione piastrinica cioè l'attivazione dell'integrina Alfa due diretta trenta direttamente responsabile dell'aggregazione
Ora questo a richiamato questo problema richiamato in questi ultimi anni l'interesse di parecchi gruppi anche del nostro ahimè siamo partiti da una da una evidenza abbastanza recente e cioè che il recettore GP uno dei nove cinque è fisicamente associato sulla membrana piastrinica a un immuno recettore che lette cita mai R due precettore per il frammento e feci delle immunoglobuline che copre CP tra tutte le volte che viene precipitato il recettore spesso e noi sappiamo anche che un recettore analogo presenti su altri cellule sui linfociti
Può andare incontro mette in moto dei meccanismi di trasduzione del segnale quando incontra clusterizzazione
Ora ha dato alla natura Multimedica del fattore di cortile veranda è facile immaginare che
Il fattore di compilerà non possono determinare una clusterizzazione del suo recettore trascinando anche il recettore feci camere due ma che potrebbe in questo modo dare incontro possono a clusterizzazione e conseguentemente naturalmente al primo atto della cascata di trasduzione del segnale che la fosforilazione
Per verificare questo primo punto noi abbiamo ha trattato le piastrine contraffattore di con ville per andare e abbiamo precipitato in uno precipitato con un anticorpo anti precettore feci camere dura e vediamo che compratore di condire bravi recettore va incontro a fosforilazione questo brano Thing anti fosso tirosina
La stessa cosa succede
Se noi partiamo le piastrine con un anticorpo che determini in condizioni tali da determinare clusterizzazione del recettore de di mutare il settore quindi effettivamente la clusterizzazione del recettore si traduce in una fosforilazione del recettore spesso
Non solo da
Se noi trattiamo le piastrine pre partiamo le piastrine con una inibitore delle sale chinasi cioè colpi più andrà lasciate perdere questa lente noetheriano che la fosforilazione prodotto dal trattore di pontile per la scomparsa
Quindi possiamo costruire iniziare a costruire una uno schema di quello che stiamo studiando
Per dire che il fattore di condire le brande termine legandosi al GP uno nove cinque determina clusterizzazione delle feci camere due AA questo viene fosforilata uno ad opera di una chinarsi Sarca
Non solo ma sappiamo anche questo è stato detto da altri che questo stesso meccanismo è in toto dal fattore di conti il non solo sulle feci camere durava anche su un altro in uno recettore che è la catena gamma del recettore esserci
Il quale è coinvolto in altri tipi di meccanismi nella funzionalità piastrinica ma comunque è coinvolto anche nella attivazione piastrinica da fattore di consiglio per e vedremo che questa evidenza ci tornerà utile in seguito ora Dian quindi a questo punto ho cercato di studiare quali fossero le dire che partendo dalla dalla clusterizzazione del recettore andassero avanti nel meccanismo della fosforilazione abbiamo trovato due proteine che sono latino Genchi Nasi si che e la PLC Gamma due le quali vanno incontro a fosforilazione
Quando le piastrine vengono trattate dittatore ricordi le brande e questa fosforilazione viene parzialmente inibita sia l'una che l'altra quando lei piastrine sono trattate con un anticorpo che sia in grado di inibire il meccanismo della clusterizzazione delle feci camere due cioè quindi sì anticorpo che blocchi il gesto del meccanismo di cui parlavamo prima
Non solo ma abbiamo anche visto che se noi complice tal modo iniziamo la chinasi sì gran noi non ha non abbiamo alla fosforilazione della TLC Gamma due cioè in presenza del PC e per no no abbiamo che lato sua relazione della
Io alle cicale ma due non avviene
Viene inibita quindi questo questo ci consente di arricchire un pochino il nostro schema per dire che la clusterizzazione del recettore e la sua fosforilazione
è in grado di reclutare chic che viene in seguito a questo attivato e fosfori lato
La fosforilazione dissi ricca e l'attivazione di sì sono responsabili dell'attivazione della fosforilazione dell'attivazione della PLC Gamma due
A questo meccanismo di attivazione collabora anche l'altro in un recettore di cui abbiamo parlato prima che pure è in grado di reclutare site di attivarlo e di colpi di collaborare all'attivazione della PLC Gamma due
Ora il problema a questo punto quale d'accordo
Il fattore di conti in regola attiva la PLC Gamma due ma è effettivamente questo
Il meccanismo responsabile di tutti gli eventi a valle che poi si traducono nella alla fine dell'aggregazione piastrinica
Cioè in altri termini questa PLC canna due è quella che è poi responsabile dell'attivazione
Per la protein chinasi C e di tutto quanto ne consegue perché qui illustrato ne sappiamo che narco sfori pacifici
è responsabile della produzione del di agibilità glicerolo degli Pitrè dell'attivazione della picca Pacini che fosse fuori la la piastrina che responsabile della secrezione dei granuli che è responsabile degli effetti finali dell'attivazione piastrinica
Sono la stessa cosa questa PLC Gamma due e questo a Fossoli basici che effettivamente fa tutto questo
Perché a dire a questo punto noi abbiamo incubato le piastrine con fossato radioattivo
Abbiamo attivato naturalmente con la fattore di pontile branda e siamo andati a vedere se la piccata ci era attiva cioè siamo andati a vedere se la plexi trina
Che è Anna proteina quarantasette chilo d'Alton andasse incontro la fosforilazione
E questo è quello che succede il fattore di convegni labbra in assenza di altre molecole da a fosforilare questa proteina quarantasette tiro d'alto no
Posso dilazione vedete che scompare
Se le piastrine vengono pretrattati e con una con quello stesso anticorpo che impedisce la clusterizzazione delle feci camere due a cioè che impedisce l'innesco di tutto il sistema di cui stiamo parlando non solo
Ma
Noi sappiamo l'evento successivo rispetto alla fu sua relazione della piastrina e la secrezione dei grandi anche in questo caso vedete il fattore dico Villagrande terminasse creazione dei granuli
Del non credo che ci sia tempo per entrare in dettagli tecnici misurata comunque dal rilascio di serotonina
Questa secrezione dei granuli viene completamente inedita se noi blocchiamo la clusterizzazione del recettore di quel bianco titolato parlare
Una conferma ulteriore deriva dal fatto che se noi blocchiamo Sitka con un Ebit con indico solito PC etanolo che l'inibitore Riscica anche in questo caso
Vediamo che viene completamente bloccata la secrezione il fenomeno della secrezione di gravi quindi a questo punto possiamo
Riallacciarsi allo schema di prima e possiamo effettivamente dire che l'attivazione di questa fosforico case di questa isoforma della fosfolipasi C al che viene attivata tramite un meccanismo FC camere dura dipendente e con la collaborazione dell'altro recettore degli motore Centore effettivamente al meccanismo che determina la fosse la attivazione
Perciò cioè
E determina effettivamente
L'attivazione dell'Attica pacifica e tutti gli eventi che conseguono a questo
A questo punto si poneva un altro problema in una delle prime figure di abbiamo fatto vedere che il fattore di condire prende termina attivazione della produzione di trombo sano e conseguentemente deve determinare attivazione della fosfolipasi a che naturalmente responsabile del rilascio di una certa diaspora chilometri così
Allora abbiamo voluto vedere quale ruolo avesse questo trombo saranno nella nello schema che stiamo che stiamo costruendo
Sempre in curvando le piastrine con fossato radioattivo e andando a studiare la fosforilazione della lex Perina noi vediamo che se noi blocchiamo con aspirina la attività nelle piastrine
Scusate la ciclossigenasi quindi la sintesi del trombo sano noi non abbiamo
Cospirazione di per l'Extreme ne abbiamo reazione di rilascio cioè se non è attiva la ciclossigenasi cioè se non viene prodotto rombo saranno pur essendo attivi tutti i meccanismi di cui abbiamo parlato fino adesso
L'attivazione piastrinica non si verifica quindi non basta l'attivazione da questo la clusterizzazione del recettore eccetera eccetera è anche necessario che venga prodotto trombo sano
Ora peraltro i due eventi
Sono indipendenti tra di loro cioè in altri termini se noi blocchiamo con aspirina o con indomita Cina la ciclossigenasi e quindi non facciamo trombo Sandro la fosforilazione delle feci camere dov'era da fattore di conchiglie PRA avviene normalmente
Non viene per nulla inibita e neppure viene inibita la
E neppure viene inibita la per la produzione di trombosi sanno dalla dal blocco della recettore feci camere due col solito anticorpo
Che impedisce la clusterizzazione quindi cento ai blocchiamo
La lettrici camere due che non lo faccia anche da strizzare il trombo saranno viene prodotto normalmente se noi blocchiamo il trombo sanno ma la sintesi trombo saranno le feci camere due che nel fosso rilevato normalmente quindi si tratta
I due vie di segnalazione indipendenti tradito ma che sono tutte e due necessarie
Perché la Fossoli Pasi cicca ma due sia effettivamente attiva quindi noi dobbiamo completare questo schema in questo modo
Cioè perché la fosfolipasi C Gamma due metta in moto tutti e venti finali della delle dell'attivazione piastrinica è necessario che si metta in moto un meccanismo mediato dalle feci camere due anche a indipendente
Dal meccanismo di produzione del trombo lasciano ma tutte e due sono necessarie l'asse seguendo le blocchiamo uno dei due l'attivazione piastrinica e non si verifica
Allora ovviamente adesso l'ultima parte della del del problema sta nel collegare fattore di pontile branda con la produzione di promossa quindi a questo punto noi dovevamo trovare a degli
Così dei delle particelle di segnalazione che fossero indipendenti nella loro attivazione dalla clusterizzazione del recettore
No cioè dobbiamo cercare delle proteine che vanno incontro fosforilazione in tirosina indipendente dal meccanismo che abbiamo visto prima
E ne abbiamo trovate alcune in particolare
Ecco va be'quindi si mette in evidenza che noi dobbiamo naturalmente prevedere di attivare la fosfolipasi A due A che è la diretta responsabile la produzione di acido arachidonico
Elian trovate dicevo due e queste due sono lati Rosin Ginasi x due la quale va incontro a fosforilazione con il fattore di fondi librari e questa fosforilazione non è per nulla inibita dalla
Dal solito anticorpo che blocca la clusterizzazione
La stessa cosa vale per la P trentotto macchina così anche questa è presente nelle piastrine viene fosforilata danzatore di confini labbra e non viene inibita questa fosforilazione dalla
Dall'anticorpo che blocca la clusterizzazione
In particolare
Ecco forse qui posso
Tornare un attimo indietro per dire semplicemente perché l'attivazione della Pete due è indipendente da tutto quello indipendente dal trombo sano e da tutto quello che esiste a valle
Della dell'attivazione della fascicoli Paci Gamma due cioè i prodotti di dell'attivazione della chi capaci non hanno nessuna influenza sull'attivazione Dell'Atti due ne naturalmente l'abbiamo già detto questa attivazione dipendente dalla fosse un'illazione della della nostro recettore del nostro immuno recettore
Quindi possiamo celebre per niente ma peraltro la cosa interessante queste che la fosforilazione della pittura indotta dal fattore di fondi LeBron come vedete tiene inedita dal eccetera no cioè che è il solito inibitore di Sitka di cui abbiamo parlato prima
Cioè in altri termini possiamo arricchire il nostro schema in questo modo cioè
Sì crea
Detto oltre che essere responsabile l'attivazione della PLC Gamma due e anche responsabile dalla fosforilazione di Pete due
No
E questo non è in contrasto con il fatto che la questa fosforilazione non dipende dalla recettore feci camere doveva perché noi sappiamo che si che viene anche attivato tramite quest'altra via
Di cui abbiamo accennato prima mediata dalla catena gamma del recettore
L'altra proteina che ha attirato la nostra attenzione è stata come abbiam detto la P trentotto macchine anzi la quale
Viene come vedete Fossoli lata dal fattore di fondi la branca questa fosforilazione determina attivazione della proteina che diventa come misurato propongono un suo substrato specifica
L'attivazione della della fosforilazione della chinasi
Non dipende dal fattore feci camere due a cioè non viene bloccata dal solito anticorpo che blocca la clusterizzazione non dipende dalla sintesi troppo sanno cioè avviene anche in presenza di dove tra Cina o di aspirina che sono dei inibitori della sintesi Ultron bussa
Ma la fosforilazione dalla della della Peter dotato mattinata anche in questo caso è bloccata dagli inibitori dissi celtici etanolo come vedete blocca completamente la fosforilazione delle P trentotto mattina
Quindi ritornando al nostro schema dei possiamo dire che l'attivazione di circa porta all'attivazione della P trentotto alla fosforilazione
E all'attivazione del P trentotto no mattina casi e che questo evento è probabilmente abbia messo un punto interrogativo mediato dall'articolo centinaia CPT Tour
Per manca un anello macula nello che leghi la P trentotto mattina ASI all'attivazione della fosfolipasi A due
E questo anello riteniamo di averlo chiuso abbastanza recentemente mettendo in evidenza che l'inibizione della P trentotto marchi nasce con i pittori specifico previene l'aggregazione
Cioè l'aggregazione piastrinica inibita
Viene inibita inibendo la P trentotto mattina vasi e inibisce anche il re lasciò di acido arachidonico indotto dal fattore di condirettore quindi in inibisce la reazione la reazione la reazione di rilascio non solo ma abbiamo anche visto che se noi invidiamo la la P trentotto macchine anzi e confrontiamo il pattern elettroforetica o in presenza in assenza dell'inibitore noi vediamo che con il solo fattore di conchiglie branda diamo uno sdoppiamento della banda
E si ottiene lottando contro complotto impianti Fossoli pagina due
E questo sdoppiamento è dovuto alla fosse stato dimostrato essere dovuto alla fosforilazione della Fossoli Pasi a due
Questo sdoppiamento della banda non avviene se no voi iniziando la P trentotto macchinari
Quindi questo è una conferma che la P trentotto all'attivazione del P trentotto macchine ASI Air responsabile
Dell'attivazione della fosfolipasi al due cioè la sua inibizione si traduce in una non attivazione da Fossoli Paci
Berlusconi pagina due
Ecco questo è un po'così la
Sintesi di quanto noi stiamo facendo nella su questi aspetti delle mostre se nel nostro laboratorio ripeto riteniamo che sia un aspetto importante
Abbiamo messo in evidenza che un
Esistono anche altri meccanismi invocati per l'attivazione delle piastrine da parte di fattore di continuo naturalmente
E saranno indicati nella prossima figura noi comunque avremmo messo in evidenza che esistono che il fattore di consiglio tranne in grado di innescare due vie di trasduzione del segnale tra di loro indipendenti ma tra di loro fortemente complementari
Una primaria che necessità del recettore feci gamma due a e dalla e delle sue triplice sito della sua clusterizzazione un'altra via completamente indipendente da questo recettore
Ma dipendente da un altro immuno recettore che la catena gamma del recettore che ci che porta tramite l'attivazione sempre di sì che della P trentotto macchine Asia l'attivazione a Fossoli pagina due e quindi alla produzione di Tron possano la contemporanea azione sulla di di queste due vie
Si traduce nella attivazione della Fossoli pagliacci Gamma due quindi conseguentemente in tutti gli eventi che seguono che seguono l'attivazione del PIL capaci
Questo è uno schema più generale nel quale ci mettono in evidenza tutta una serie di altri dati raccolti dalla letteratura
Che dicono appunto come il fattore di Pontida con anche nel
Ne abbia studiato diciamo questa parte del problema
E che comunque sia gli eventi messo in moto dal pretore di conti le prima si traducono poi in un'attivazione dell'integrina alfa due vive da tre che è la responsabile del legame col fibrinogeno e quindi dell'aggregazione piastrinica e quindi in questo modo si collega illa l'attivazione del recettore
Alla attivazione e all'aggregazione piastrinica ripeto l'interesse che noi riteniamo rivestono queste questo tipo di argomento sta soprattutto nel fatto che con ogni probabilità
Dire che tutti sono d'accordo su questo aspetto questi meccanismi sono i primi che intervengono sia nelle mostre si così traumatica diciamo così sia soprattutto e questo soprattutto credo l'interesse anche più tecnologico sia nelle Mostosi patologica dovuta a lesione patologico di un
Per questo è
Il gruppo delle persone stanno occupando a Pavia di questo argomento che sono ovviamente le maggiori così responsabili dei risultati che noi abbiamo tenuto perché io mi sono permesso di riferirvi grazie
Grazie altri professor Balduini per questa chiara esposizione il fattore di fondi le Brancher ricordato a cento anni fa un brillante ore nella nella tomba se e come si suol dire questa volta si può rivoltare per la meraviglia se non vere per l'entusiasmo di come siano stati chiariti i meccanismi che lui non potevano essere razionalmente nodi né immaginati annui non ci meraviglia il fatto che molti chinasi siano coinvolte in questi processi ci sono domande per questo brodo in
Prego
No mi chiedevo
Anche se ogni tanto competente o piani di questo campo però mi chiedevo insieme al fattore di ciambelle bravi
E la corrente natica e ci sono tante immunoglobuline corrono continuamente Amber la concentrazione
Ciascuna con il suo FC
Allora mi chiedeva ti chiedo
Dare a iniziate ieri
Enti che servano per e Masters
Sono dovuti all'uno o all'altro a tutti e due insieme cioè arrivo del fattore che alle cose che tu hai fatto vedere ma anche l'arrivo di immunoglobuline con il loro FC
Prenotato che in tutti i nostri in tutti i nostri i risultati c'è un controllo con delle immunoglobuline generiche che non mettono in moto questo meccanismo
La l'immunoglobulina di per sé non è in grado di determinare la clusterizzazione delle feci camere due anni e quindi non è in grado di determinare la auto opuscoli l'azione quindi di far partire
Di far partire questo segnale questo è quello che e quindi i fattori compilerà tiene conto che è una può diventare una una grossa molecolare una Montinaro
A una affinità molto specifica nei confronti del recettore qui non sarebbe tanto il legame al recettore FC che determinava clusterizzazione quanto il legame ad un recettore che era associato con recettore
Il precettore feci
Anche noi ovviamente abbiamo avuto questo Gubbio e abbiamo il fatto tutta una serie di controlli tante condizioni diverse usando immunoglobuline diverse e con le immunoglobuline non si mette in moto nelle piastrine questo meccanismo
No non cluster Izzo
Prego mai
Sì sì sì sì cattiva la facilità asimmetria sì
Quello che è stato fatto con la catena Cammardella recettore FC è stato fatto
Prima di tutto sui linfociti e si succede che la prosperità Sicilia per due giri di vite piene attivata da chic
Non ho altre domande
Posso io corte dei conti domanda da inesperto totale ci può avere aggregazione piastrinica senza attivazione
L'avvocato Ennio no no direi di no cioè la la la l'aggregazione piastrinica può avere diversi gradi esser definito reversibili avrebbe ma prenderei Antonio comunque sempre deve mettere in moto alcuni meccanismi di attivazione ci conoscono patologie anomalie mutazioni nulla di queste vie ma ben direi certamente che con
Però direi che malattie dovute ad una mutazione di una di queste componenti di segnalazione di cui abbiamo parlato non ne sono no sono meno io non ne conosco forse qualcuno qui riconosce qualcosa di più ma non credo proprio quando in clinica si determina setosa l'aggregazione piastrinica
Sì bei si vede il Fanum uno che ne vale insomma un presso il CET nessuno di questi fattori più direttamente implicato matto per l'aggregazione del Stephen resta in clinica sita utilizzando una un attivatore forte che al collagene
Che quindi è una è una cosa ridicola l'ente non fisiologi non sento dire nessuno di questi fattori il più significativo il principalmente in implicato
Ma qua sono tutti connessi
Dirette da per quanto riguarda la funzionalità Testini caccia certamente una ridondanza di meccanismi no la Triestina attivata da una miriade di fattori diversi però come accennavo questi sono tutti importanti perché intervengono in situazioni di flusso diverso da diverso la situazione sul tuo studi in vitro le piastrine in una provetta mettendo collagene e allora tu vedi l'attivazione una per esempio se tu fai una valutazione in in simulando una situazione di flusso e fai andare su una una una superficie delle piastrine una superficie di collagene delle piastrine di collagene di fattori convive grande delle piastrine che mancano della GP uno di cinque nove il collare sono in questo caso non è in grado di attivare prima quindi per questo io dico in condizioni di flusso con ogni probabilità il meccanismo che condiziona tutti gli altri che pure sono ovviamente importanti è questo meccanismo innescato dal fattore di birra dal quale poi dipendono tutti gli altri
Ok questo forse spiega anche il fatto che i tentativi di prevenzione e così via fatti agendo a valle sul sui sui meccanismi finale della creazione danno dei risultati abbastanza modesti quindi la speranza che si possa intervenire invece intervenendo molto più a monte
Grazie
Adesso tocca alla professoressa Sinigalia dell'università di Novara del Piemonte orientale non so quale preferisca
Acf settore inespresso e da un un un manto l'attrezzo offese al moduli tentare Francia quindi siamo sempre in termini di piastrine
Grazie dopo un attimo di panico
Che nel passare da un sistema
Qui c'è un sistema Macintosh può sempre succedere di tutto
Credo che potrò mostrarvi la mia presentazione dunque
Questo è un lavoro che si in qualche misura si può ricollegare a a quanto tutto quanto vi è raccontato Cesare Balduini
Ecco questa però una ricerca che è nata da pochissimo tempo
è nata così da come come frutto di una collaborazione con un laboratorio che sta Justine Franco il vino che ha un laboratorio di Istologia che si occupa di questo fattore di crescita H GF da molto tempo
H Geas
Definito anche scatta perfetta un una proteina costituita da due subunità una subunità alfa una subunità beta tenute insieme da un ponte disolfuro
Però punita alta abbiamo cinque Domaine unendo non Dominioni né terminale quattro Krhin Baudo mensa
Nella subunità beta abbiamo un unico Grosso Domenico di circa quaranta chiodato il quale a una sequenza
Largamente omologa a quella delle Céline proteasi non è però dotato di attività enzimatica poiché è intervenuta una mutazione in un amminoacido chiave per l'attività enzimatica
Questo fattore viene prodotto da un gran numero di tipi cellulari derivazione epiteliale come un'unica catena polipeptidica
Molti tessuti dunque lo producono cuore rene polmone
E viene riversato nel sangue dove può andare incontro a attivazione in seguito ad un intervento proteolitico adotterà per l'appunto di seri proteasi plasmatiche
Le azioni di questo fattore sono molteplici
E dipendono in larga misura del tipo cellulare nonché dalle condizioni di cultura utilizzate in particolare che Agf induce eletti proliferati
Manifesta un'azione anche occupata ottica inoltre promuove scattering e questo è uno dei suoi aspetti peculiari nonché aumenta la motilità delle cellule epiteliali
Inoltre a un'azione molto genetica in quanto induce formazione di tuguri
Oltre a questi a spetti che in certa misura condivide con altri fattori di crescita H TF
A dei legami piuttosto stretti devo dire con eventi tipo trombo ottico
Infatti
Piuttosto di recente è stato visto che
Nel momento in cui si vengono a generare venti di tipo Trumbo ottico se ha un aumento più o meno marcato di a capienza
It circolante
Questo e vento particolarmente evidente in un in nella nella trombosi arteriosa sperimentale abbiamo un aumento infatti di più di cinque volte
Della concentrazione di H chiesta ma un evento analogo si verifica anche impazienti che siano stati ricoverati per attacchi angina osé così come per in infarto cerebrale e anche anche se qui non è riportato in seguito ad infarto al miocardio
Questa cosa già di per sé ci ha incuriosito per un motivo se vogliamo banale che è quello che i trombi li fanno le piastrine ma se questo non basta se c'è un altro tipo di evidenza riportati in letteratura e questa piuttosto
Datata se vogliamo
Ed è che H Agf e presente nelle piastrine sia di ratto ma anche umane in concentrazioni decisamente elevate ricordiamo che di Agf e stato purificato per la prima volta da piastrine tirato nel mille novecentottantasei
Tuttavia le piastrine non si sa dove conservino H Ginestra verosimilmente non nei granuli secreti posto che la stimolazione con un agonisti fisiologici non promuove rilancio di accoglienza dalle piastre
Quindi tutto questo ci è sembrato piuttosto intrigante e
C'ha stimolato ad iniziare appunto una ricerca finalizzata a rispondere a tutta una serie di domande prima di tutto se ci siamo chiesti se le piastrine esprimano il recettore per la capienza e in caso di risposta affermativa se questo recettore è funzionalmente attivo
Dopo di ciò
La domanda che ci siamo posti è se H gesto può influenzare la funzionalità piastrinica
E se le cose fossero andate come speravamo ci siamo proposti di caratterizzare la via di segnalazione legata alla formazione del Complesso H GSM
A caccia essa a un unico recettore noto ben caratterizzato e profondamente studiato trattarsi di da un tipico recettore tirosina chinasi
Il quale una volta reclutato data Agf di merita
Va incontro processi Trasauto fosforilazione e le Fosco tirosina fungono da centro di nucleazione per tutta una serie di proteina dal di proteine ad altre attrici eh
E trasduttori responsabili delle risposte cellulari time peculiare una segnalazione di Metta
Una l'esistenza di Capuana il quale è una proteina data attrice che rappresenta peraltro anche il principale substrato rimetto
Pertanto abbiamo due possibilità o nucleazione direttamente sulle fosso tirosine dimetto duplicazione sulle fosso tirosine di tabù anche
La segnalazione di menta risulta ulteriormente complicate questa a dir la verità del si verifica anche per altri recettori attivo inchinarsi dalla possibilità che questi recettori hanno di etero di me rizzare con altre proteine di membrana
E nel caso di a cantieri sono stati individuati de il delle diciamo dei a dei compensi
Recettoriali funzionali di metta con l'integrina alfa si è detta quattro mette con il recettore per le semafori in emette con il CD quarantaquattro ricettore per l'acido ialuronico
Naturalmente non possiamo escludere che anche oggi adesso Possa di me rizzare con altre proteine di membrana ancora arricchendo ulteriormente la tipologia di segnali che vengono avviati all'interno della cellula e che restano dunque in larga misura determinati dalla architettura di membrana della cellula che viene stimolata da a caccia
La la risposta alla prima domanda che ci siamo posti la vedete chiaramente da questa che positiva dove da esperimenti di cito plurime tria abbiamo ottenuto una chiara evidenza dell'esistenza di mette sulla superficie piastrinica
La quantità se così possiamo dire di recettore Espresso risulta apprezzabile è piuttosto dispersa però come vedete la quantità di fluorescenza nella popolazione cellulare
Che espone il recettore e dunque dobbiamo
Dobbiamo credere che
Le piastrine espongano di fatto quantità abbastanza variabili di me
Metta
Nelle piastrine
Non solo è presente ma è anche funzionalmente attivo
E infatti H GS
è in grado di indurre fosforilazione in tirosina ter recettori
Abbiamo incubato delle piastrine per tempi crescenti con una capienza
E dopo aderimmo precipitato il recettore siamo andati verificarne lo stato di fosforilazione in tirosina vedete come in tempi brevissimi compare una netta banda di fosforilazione tirosina che tende a scemare
Riportandosi a tre minuti ai livelli paragonabili a quelli del controllo e ciò significa che non solo il recettore attivo ma che sono pure attivi dei meccanismi di spegnimento della del recettore stesso
Un'ulteriore prova della funzionalità del recettore l'abbiamo ottenuta da esperimenti di cui uno precipitazioni
Metta in uno precipitato dopo che le cellule erano che ripristinano state trattate con una capienza
Risulti
Già associato a proteine che sono tipiche come abbiamo visto delle segnalazioni di mette in particolare Capuana
E piante di cannabis
Il questa associazione è ancora una volta reversibile e tende a scemare piuttosto rapidamente nel tempo
Posto che metta oltre che formare degli Omo di Mary
Si dimostra essere in grado di formare anche degli etero di Mary
Così quasi per scherzo diciamo abbiamo provato a saggiare gli Induno precipitati
Con anticorpi specifici contro metta con una anticorpi dirette nei confronti di dico proteine specifiche del mancano piastrinica
E quello che abbiamo verificato
E che
Dopo stimolazione con H GF si verifica una consistente associazione della glicoproteina uno B dico proteine nobili
Che ormai tutti voi sapete è il recettore per i fondi le prende
Devo aggiungere che non solo nel settore per i fondi del rendez ma e anche uno dei possibili recettori per la trombina
Ulteriore
Sviluppo di questa ricerca è è stato quello di cercare di capire se
Visto che esiste recettore visto che funzionalmente attivo H gesto può fare qualcosa sulle piastrine
Beh la risposta è stata no H già di per sé non è capace di fare assolutamente nulla sulle piastrine
Infatti come potete vedere da queste curve di aggregazione non esista alcuna differenza nel tracciato tenuto conto in sede di controllo e nel tracciato ottenuto stimolando le piastrine con H GR cento nanogrammi perenne
Perdette quello che il tracciato ottenuto con stimolando le cellule con trombina anche il più potente agonista piastrinico e con nostra grande sorpresa però andando a stimolare con trombina delle cellule Penghua te con H GF abbiamo ottenuto questo risultato
L'aggregazione inibita significativamente e di conseguenza questo risultato ci porta a concludere che ha chiesto può esercitare un effetto inibitorio
Anche su questa anche a carico di questo tipo di stimolazione che certamente il più potente
A quelli noti
Abbiamo approfondito questo tipo di studio andando ad analizzarne le caratteristiche e abbiamo visto che l'inibizione esercitata data Agf sulla aggregazioni indotta dalla trombina presenta caratteristiche di dose dipendenza e di tempo dipendenza
Da essi si me dosi di atta GS sono in grado di indurre un'inibizione dell'aggregazione di circa venti per cento
Analoghi valori otteniamo con dieci nanogrammi per l'immediata chiesta vedete che con dose di cento nanogrammi per e mail di Agf abbiamo inibizioni che raggiungono anche il sessanta per cento
Questa dose dicendo no grandi per e mail a dir la verità e considerata piuttosto elevata quanto meno dei farmacologiche
Tuttavia dobbiamo considerare un aspetto è piuttosto verosimile che le concentrazioni di questo fattore di crescita nei dintorni del trombo cioè dell'aggregato siano molto molto più alte di quelle sistemiche cioè di quelle che vengono misurate
Nel Midi un circostante
Perfetto di Agf estremamente rapido vedete già in cui bando con Arcadia e per tempi brevi dieci al massimo trenta secondi abbiamo una manifestazione pressoché massima del potere inibitorio di questa molecola
Abbiamo iniziato uno studio è solo un inizio e dunque i dati sono certamente preliminari abbiamo però cercato di capire che cosa possa accadere
Nel momento in cui le piastrine vengono sottoposte a una doppia stimolazione da parte di trombina da parte di hacker cinesi
E abbiamo affrontato il problema andando a analizzare lo stato di fosforilazione della recettore netta
Andante dopo incubazione delle piastrine con il sola perché a essa con la sola trombina e con la coppia a Javier trombi
Abbiamo già visto come H Chieffi induca fosforilazione del recettore trombina invece non induce assolutamente nulla e inattiva nei confronti del recettore
La coppia invece sembra mostrare un effetto sinergico relativamente a questo tipo di fenomeno
A questo punto
Più che altro per chiarire le idee a me stessa
Ho cercato di costruire un modellino e vedo avvenimento parte premettendo che trattasi di modello del tutto ipotetico e che necessità senz'altro di essere verificato
In questo modello inserito qui pochi dati che fino ad ora non siamo riusciti a produrre con certezza cioè che cosa succede verosimilmente quando stimoliamo le cellule con il solo H chiesta devo credere che Akagi esporsi indurre dimerizzazione del recettore abbiamo visto che recettori ci può sorridere abbiamo visto che recluta da buone Pietri Cagnes
Abbiamo però anche visto che
H neanche il il recettore ammetta stimolato
Associa a ci più ampi
Nessuna di queste due
Nessuno di questi due eventi esita in una risposta piastrinica che noi siamo stati in grado di mettere in evidenza non possiamo ne non possiamo escluderei che le piastre dentro le testine qualcosa succeda quello che noi fino ad ora abbiamo fatto non ci ha consentito di mettono in evidenza
Se insieme era capienza
Le piastrine vengono sollecitate anche dall'agonista trombina lo scenario cambia completamente trombina riconosce sulla superficie piastrinica un cospicuo numero di recettori in primis dei recettori se Vespa anni
Che
Insieme a G più ambiti
Provocano
Nelle piastrine adesione aggregazione formazione del trombo
Ma se c'è trombina insieme a Kakà GS quello che noi verifichiamo e che questi fenomeni vengono in qualche misura limitati poiché noi abbiamo registrato una cospicue inibizione dell'aggregazione
Ci piace pensare però ripeto non abbiamo ancora nessuna evidenza a questo proposito che in qualche modo questo fenomeno possa essere conseguenza la formazioni di questo complesso
In realtà hanno bello è probabilmente ancora più complicato
Perché non solo trombina inibita da tangenza ma anche altri agonisti e come vedete in questo grafico un quarantasei viene praticamente bloccato dalla presenza di a capienza nel mezzo
Se noi
Preoccupiamo richiesti né quella caccia accentuano molare abbiamo inibizione di quasi il cento per cento delle aggregazioni indotta da un quarantasei
Lui tempo è ugualmente rapido quindi H Chieffi instaura la sua azione con grandissima efficienza grandissima rapidità
Per concludere
Tiro le fila di quelli che sono stati i risultati che noi abbiamo fino ad ora ha raccolto e che sono innanzitutto una dimostrazione questa è la prima volta che sia ottima dimostrazione di questo tipo che le piastrine esprimono metta cioè il recettore di a capienza
Ha chiesto
In grado di
Modulare negativamente l'aggregazione indotta da agonisti quali trombina e l'analogo del trombo sano o quarantasei
Il seguito a trattamento Conac Agf noi abbiamo tutta una serie di e venti a carico di metta netto va incontro a rapida e reversibile fosforilazione in tirosina ammette si associa con Capuani Pietri cani Nese e metta associa anche una a Santa adesso associasse è una glicoproteina recettori per i fondi il rendez anche per la trombina l'amico Putin uno bit
Ora l'attivazione di mettere come abbiamo visto è indotta senza sindaca Jeff ma non da trombina tuttavia
Abbiamo visto come si verifica una si nettizzazione dell'attivazione quanto meno considerata secondo il criteri canonici di fosforilazione in tirosina
E ringrazio per l'attenzione
Ringraziamo professoressa Sinigaglia e chiediamo se ci sono domande
Qualcuno ha qualche cosa da chiedere
Prego
Di capire che quello com'è che interpretiamo quella un vento di HCV perché sia nei fenomeni di Tours Roma prima di avere un secondo che è positiva cioè è un meccanismo di difesa che viene messo in moto controllo
Ecco direi che questa è l'interpretazione che io in base ai nostri dati tenderei a dare in questo momento certo H gesta tutta una serie di altri insetti chiaramente che sono quelli di promuovere la rigenerazione tissutale eccetera eccetera
E a accanto a questi
Potrebbe avere potrebbe rappresentare uno dei sistemi di controllo fisiologico della crescita del del tronco
E in questo forse potrebbe essere un il futuro biotecnologico di questo di questo tipo di studi
Chiede che oltre le piastrine dove dove si trova
All'interno di altre cellule
Non non mi risulta che che si è che si conservi ma avviene proprio secreto
E in generale sono per l'appunto tessuti rivendicazioni Pitigliani e quindi anche lo stesso Dottesio
Ricercati forse completa la domanda del Cesare Balduini e ci Francesco
L'origine nel di questo marchio GF che aumenta di dieci volte in seguito a trombosi sperimentale in circolo nel plasma
E dalle piastrine
Traduzione
Prima seconda domanda sono altre cellule circolanti che abbiano recettori per la Cagiva fare oltre le diossine
Non sono in grado di risponderti
Non sono in grado di risponderti devo dire che sostenuti gli studi tra che che coinvolgano fattori di crescita e cellule circolanti sono limitatissimi anche perché
L'irrazionale forse del del del dello studio fino ad ora non è stato assolutamente messo a fuoco
Credo che un un aspetto importante da cui posso dirmi da cui deriva l'aumento va bene enorme di accoglienza sia da ricercarsi
Nell'attivazione del Sarin proteasi che abbiamo nel nel momento in cui si innesca un processo di tipo trombo ottico ricordiamo che l'attivazione via tergiversa e proprio legata
Alla disponibilità di Céline proteasi possono essere del Lucchina esiti Pia
Gli stessi fattori della coagulazione
Pertanto nel momento in cui abbiamo disponibilità di attiva attori e naturalmente aumenta in maniera esponenziale anche la la disponibilità che ha che ci
I dati che io ho trovato me non l'abbiamo fatto esperimenti ancora riguardo però il letterato è riportato che ad Agf non è secreto dalle Palestrina animali contro siccome però una cosa che mi ripropongo di verificare nelle
Nel nostro laboratorio perché c'è capito bene eversive ce l'hanno c'è ma non lo non lo liberano incatenata sapete allora questo grandissimo menta non è di derivazione piastrinica e quindi delle sedi altre derivazioni
Diciamo
Grazie
Passo la parola posso Balduini
Nelle prossime ore
Relazione di Rossi Brandi ma la testa se perfino Chéreau Filippi e ricevere celeste schierata nell'occasione Libania mi e spesso offrono l'estero l'analisi in colore del Futurshow lettera con micobatteri overview repliche Shall we can macro princess
Prego
Cambiare
Il micobatteri Mario ma è un microspie
Responsabile
Una delle più comuni infezioni opportunistiche anche insorgono Ina soggette uno compromessi come ad esempio quelli affetti dalla virus dell'immunodeficienza umano dove causa una patologia simile tubercolo piccanti
Dunque noto che con l'avvento della arte che è una terapia antiretrovirale molto potente le infezioni opportunistiche sono molto diminuite è pur vero però che Laratta non è universalmente disponibile e di un'ora
Di inoltre qualora si interrompa la terapia o questa fallisca si osserva un re Bounce delle sezioni del micobatterio ma di una e cosa importante da notare che recentemente le infezioni da micobatteri Marion colpiscono anche ai soggetti non affetti da ai DS
Si intuisce quindi che questo patogeno e rimane un patogeno di notevole interesse tuttora sia per i clinici sia per i ricercatori
Particolare in quanto e risulta difficile la sua eradicazione
Infatti il micobatterio ma di un infetta prevalentemente la cellula macrofagi campi dovesse operative si moltiplica all'interno di un popolo specializzato
E una volta all'interno e in grado di eludere e di evadere ai normali meccanismi potenti meccanismi antimicrobici che può mettere in atto la cellula ospite e qui in questa immagine immagino cruscotti Elettronica potete vedere un macro Falco infettato da un micobatteri o all'interno di un vacuolo molto stretto
Ecco questo lo sottolineo perché una caratteristica proprio dire di questo del popolo che circondano veemente Lario ma che poi vedremo per quale motivo
E quali sono i farmaci che si utilizzano normalmente nei confronti di tale patogeno si tratta per lo più dei macrolidi d'ultima generazione quali la claritromicina Rozzi trovi Cina eccetera
Però questi farmaci hanno prevalentemente è un'azione di tipo batterio statica non battericida
E si pensa che questo sia dovuta al fatto che hanno limitato accesso proprio a livello della dal popolo mito batterico
Si intuisce da qui l'importanza di avere a disposizione delle strategie che consentano di arrivare a colpire con dei farmaci direttamente il comparto la nicchia che è il
Micobatterio si è creato
E proprio in questo contesto abbiamo proponiamo la nostra strategia che prevede di inibire la replicazione del micobatterio Mario nell'interno della crossato tramite la somministrazione di eritrociti con incastonata una tossina emolitica
La Lister Rivoli sino vediamo quali sono le motivazioni che stanno alla base di questa strategia
Dunque innanzitutto il fatto che il stacco somma micobatteri Como è un fatto insomma immaturo
Questo significa che è in grado
Cioè non non matura non si fonde con il viso Solmi permane la sua capacità di fondersi con decine Tosoni tre codici contestando dei fa Cosolini anche condito accumuli contenenti altri microrganismi in caso di confezioni
E quindi noi supponiamo pensiamo che si possa fondere anche con un vacuolo contenente un eritrocita
Un caso quindi che a tali eritrociti vengono somministrati a macrofagi infettati da micobatteri un attimo ma quindi come primo step proponiamo la possibilità che il fatto insomma micobatteri Kocsis fonda con il fatto insomma eritrociti Co.
E qui vedete l'immagine di un macro foto che ha fagocitato diritto recente questo del vacuolo l'interno del quale contenuto l'eritrocita
Dunque seconda motivazione che sta alla base della strategia la possibilità che abbiamo di in capsulare farmaci all'interno del gruppo russo in tal modo quindi se abbiamo la fusione tra i due vacuoli
Un po'contenente il micobatteri l'altra contenente l'eritrocita che TARSU interno contiene un farmaco siamo quindi riusciti a portare un farmaco nell'ambiente in cui il micobatterio prolifera
Altra cosa è il farmaco che abbiamo a disposizione abbiamo pensato alla dispiegati avvicinano
La distesa di sino a un uomo e una proteina in particolare la proteina una tossina emolitica
Che ha la capacità di essere attiva a pH acido e questo per noi è particolarmente importante in quanto il Pianca che è presente all'interno del fatto sono appunto un piatti intorno e cinque cinque piatti pH sei
In questi fa consoni precoci che consentirebbero quindi l'attivazione in loco della proteina connettività tossica
Quindi si manifesterebbe la sua efficacia esclusivamente nel momento diciamo delle bisogno quanto abbiamo quella fusione dei vacuoli
Dunque la listeria lisina che abbiamo utilizzato dagli steroidi Sina ricombinante che c'è stato fornita da di attività anti ricordiamo brevemente non cosa che le liste la lisina è una proteina che tiene normalmente prodotta dare la listeria monocytogenes
Questo batterio utilizza la produzione di listello lisina proprio per fuoriuscire dall'accumulo che lo contiene una volta che il patire dell'incapace viene fagocitato dal Macro Fago così che la tossina che una purina a tre crea dei pori libero del vacuolo quindi listeria monocytogenes può uscire replicare nel medium quindi abbiamo sfruttato copiato diciamo una attività di questa tossina sine politica prodotta dalla dalla listeria monocytogenes quindi complessivamente la nostra strategia prevede questo
Dunque caricamento Santella listelli sino ricombinante all'interno del globulo rosso somministrazione di globuli rossi con l'esterno di sinistra sull'alta macrofagi infettati dal micobatterio Marion ma quindi fusione dei vacuoli abbassamento del pH attivazione della distretto di sì eccome IMO lisina che quindi consente la rottura del proprio la fuoriuscita dall'estero lisina stesse alla quale poi agirebbe
Potrebbe agire a livello delle micobatterio e non solo noi pensiamo che agisca anche a livello della membrana che ci pure che circonda il il patogeno stesse in quante particolarmente ricca di colesterolo
E la veste tunisina punto agisce prevalentemente in sintetiche di di questo strano
E come prima cosa abbiamo i verificato la capacità emolitica della nostra di specialissima ricombinante nonché per fare questo eritrociti sono stati incubato in presenza di concentrazioni quel crescenti di proteina
E in combatti in fisiologica a diversi piatti a pH acido pH neutro che H basico abbiamo portato la percentuale di Lolli si ai diversi piatte come possiamo vedere pH acido abbiamo un'elevata percentuale di emolisi ieri molto interloquisse ritrova a pH neutro mentre molto più bassa ancora pH
Basito
Calcolando poi finita in politiche che la quantità di pratica necessaria per provocare il cinquanta per cento di emolisi abbiamo rispettivamente uno due segni hanno per anni ai tre pH acido neutro e basico
Quindi cosa possiamo dire o che abbiamo una listeria lisina attiva nella sua azione emolitica vediamo se questa tossina ha un'attività una qualche attività contro micobatteri Mario Matt
E per fare questo abbiamo
Incubato
Micobatteri che crescevano i loro perfino appropriato di coltura in presenza di concentrazioni diverse di liste tunisina
A due diversi piatta piatta cinque cinque pH sette quattro e abbiamo contato la percentuale di nutrizione a due diversi tempi dopo diciotto e quarantadue quarantadue ore
Tanti presenza di potterina e come possiamo vedere eredi spero di sì ha manifestato una attività anti micobatteri ricca che è risultata concentrazione pH
E tempo dipendente Massimo Ghini persone se fatti avuta quella concentrazione più elevata trenta micro potrà microgrammi presenze cinquecento mila batterie dati H cinque cinque dopo quarantadue occorre quindi c'eravamo dunque abbiamo quindi a disposizione una tossina che attiva emolitica niente ed è in grado di e agire contenuto batte tu mandi un ma allo step successivo è stato quindi quello di impatto solare la proteina all'interno del proprio corso
La procedura che abbiamo utilizzate quelle della dialisi portoni capi sinceramente eso Toni Totti e consiste in pratica
Nella sottoporre i globuli rossi ad una
Misurati anzi Pattoni che in presenza incubate in presenza di una soluzioni poto unica che crea rigonfiamento delle eritrocita con apertura di porre di membrana
Questa in cui si aggiunge poi all'estero lisina che passa attraverso questi pori siciliani globulo rosso aggiungendo una soluzione che ripristini la Isotta unicità la richiamo rimuoviamo
La lista di Lodi siano incapsulato ampi quindi otteniamo gli eritrociti con incapsulato questa nuova molecola
E poi risultare contraddittorio a un primo momento il fatto che si vada in capsulare una tossina emolitica all'interno di un globulo rosso
E però dobbiamo dire che abbiamo messo a punto la procedura e abbiamo lavorato ad un IHI lotte quattro piatta al quale abbiamo visto essere molto bassa l'attività in politica quindi in questo caso
Abbiamo potuto lavorare tranquillamente in capsulare quindi la proteina di interesse
Abbiamo valutato la capacità dei globuli vinta sull'arena disteso lisina
E utilizzando come tracciante della disteso lisina Hoyo di nata abbiamo incubato una quantità fissa di eritrociti dializzati in presenza di concentrazioni crescenti di proteina e abbiamo ottenuto come atteso una quantità crescente di proteina incapsulato en dunque a questo punto lo step successivo e quello di somministrare globuli rossi con incapsulato era disteso lisina al macro o facoltà
Per diciamo rendere più efficace questo tipo di processo abbiamo ingegneri viziato se così come si può dire l'eritrocita abbiamo modificato
La loro superficie e creando dei cluster se irreversibili Prandi banda tre utilizzante lo zinco cloruro per formare Castel San ricordo che la banda tre uno dei principali punti netti membrane del popolo russo
E qui cluster se sono stati quelli sì reversibili dalla Giunta del di su fosse simile superate
Questi Custer se vengono riconosciuti come non SEL eritrociti sono stati imputati in plasma contenenti quindici e cinque
E delle quali hanno ottimizzato il il globulo rosso a questo punto un globulo rosso così trattato Salizzato può essere attivamente fagocitato dalla cellula ma capacità e quindici quando incominciamo diciamo a avvicinarsi alla nuca vicina c'è il nostro obiettivo
Chiaramente per lo stop attivo quali era quello che noi dobbiamo immaginare che quando somministriamo eritrociti con liste tunisini capsula alta questi possono essere fagocitati sia per la troppa ci sani che per la troppa g infettati e quindi
Vogliamo che quando sia una truffa possano a ricevere eritrocita questo non subisca alcuna tossicità abbiamo quindi valutato la concentrazione ottimale
Di liste tunisina da somministrare tramite globuli rossi qui abbiamo Magi microscopia elettronica di macrofagi ti controlla macrofagi che hanno ricevuto eritrociti sottoposti alla procedura piloti interna senza incapsulamento di rispetto lisina macrofagi Carlo ricevute eritrociti con incapsulato una bassa quantità di proteina zero otto nanogrammi per millilitro globuli rossi e e qui invece troviamo
L'immagine di macrofagi che hanno ricevuto eritrociti conica sull'atto una concentrazione cinque volte superiore siamo intorno a quattro nanogrammi come possiamo vedere in questo caso
Si osserva un inizio della decelerazione dei componenti cellulari questo quindi che cosa significa che noi dovremmo lavorare per il nostro obiettivo con una quantità di proteina iniziati ore quattro nanogrammi
Questo è quello che è stato fatto e abbiamo
Per il trattato macrofagi infettate con il mito perché rimati una con eritrociti con incapsulante quantità di vestiario dissemina nel ranch da uno ventidue a due quarantacinque nanogrammi per millilitro di e di cinque questi macrofagi sono stati infettati quattro ore circa con il micobatterio che è stato rimosso trattati con il rito Citti overnight una sola somministrazione di globuli rossi
A distanza di sette giorni se andata valutate la replicazione del micobatterio come possiamo seguire l'inibizione della replicazione del micobatterio sta correla perfettamente con la quantità di listeria lisina somministrata tramite eritrociti
è una cosa interessante da osservare
Queste immagini microscopia dove si vede un grosso vacuolo questa volta contenente il Miccoli micobatteri un attimo intanto micobatterio e degradato
La cosa interessante che vediamo che e grande la questo questo Pakula proprio in quanto c'è stata prendete la fusione con il dal ruolo contenente l'eritrocita fatti se ricordate inizialmente avevamo visto come normalmente il micobatterio che siede in un vacuolo
Molto molto stretto
Questa invece quello che viene probabilmente in seguito alle fuse alla fusione
Come risultato abbiamo tenuto fino a un massimo un cinquanta per cento di inibizione però dobbiamo ricordare che questo è stato ottenuto con una singola somministrazione di globuli rossi strizzati probabilmente somministrazioni ripetute apre però portato ad un risultato maggiore nostre volevo sottolineare il fatto che questo risultato è stato tenuto con delle quantità altera mente basse di proteina
E probabilmente questo è dovuto al fatto che a volte che si trova all'estero di sino all'interno del patto muore probabile che questo interferisca come dicevo non solo con il micobatterio
Ma probabilmente anche con la membrana poco segnale che particolarmente ricca di colesterolo in tal modo quindi e si andrebbe a perturbare proprio questa membrana rendendo il micobatterio accessibile anche all'attività battericida della cellula della cellula ospite quindi e ancora una cosa da aggiungere cantando a perturbare questa nicchia probabilmente questa strategia potrebbe anche e permettere una maggiore attività dei comuni farmaci che su utilizzano contro il micobatterio i quali sono relativamente efficaci proprio a causa del loro limitato accesso
Ripeto del vacuolo ma perturbante una membrana intanto accusa viale probabilmente questo accesso sarebbe e maggiore e quindi ci si potrebbe aspettare anche una eradicazione della infezione da anni combatteva trionfo quindi concludendo
Lasciamo diciamo che tramite la fagocitosi di eritrociti è possibile arrivare al fatto somma mito batterico
E Lannister lisina la tossina che abbiamo incapsulato ha manifestato attività contra replicazione del micobatterio Marion e questa strategia potrebbe come dicevo essere diciamo incrementata la sua attività proprio e se utilizzate in combinazione con farmaci anti micobatteri ICI ed inoltre non per ultimo dobbiamo ricordare che e altri patogeni quali micobatteri un tubercolosi si micobatteri lei responsabili di gravi patologie per l'uomo quel punto la tubercolosi e la libera in realtà si comportano in maniera analoga alato invece risiedono in queste nicchie
E e quindi difficile la loro eradicazione quindi questa strategia si può estendere anche a queste patologie
Grazie
Ci sono domande
Torino
Sì non dà lavoro complimento questo allo studio immagino preliminare avete in mente anche adesso di passare a qualche modellino animale al topo in particolare
Microfono per favore
Non per il momento adesso stiamo provando altre strategie per cercare di diminuire ancora netti Pittachi emolitica della tossine all'interno del del propulsore osso
E in maniera che Selicato sindacare un quantitativo ancora superiori sconcerto model strategie in questa direzione ancora intitolò anonima
Superiore certa sta ma non troppo però abbiamo in mente delle dei meccanismi che potrei tornarci insultato certamente in futuro
Altre domande
Posso Berto
Accennato che il risultato ottenuto bene qui qui qui a sorgeva
Mi scusi lei
Titolo ottenuto è stato fatto in seguito a un'unica somministrazione
Ipotizzando che siano possibili più somministrazione se noi andiamo in vivo questo è sigla però la mia domanda mi lascia sempre incompetenti
Lo stesso macro foco può fagocitare più di un globulo rosso
E rilettura mezzo mondo cioè unicamente mancavano allora il nostro caso noi abbiamo noi sappiamo che con questa somministrazione ne fagocita uno mille mediamente uno due però poi se ripetiamo una uno due in un unico panificio unico cioè come media serico uno uno sì ecco mediamente fagocita un altro faccia però se no e poi ripetiamo una somministrazione a distanza di qualche giorno in maniera troppo avete nuove in grado di fagocitare altri
In realtà citi sicuramente
Una curiosità ma la listeria lisina non danneggia globulo rosso
E altri atti al quale abbiamo lavorato noi molto poco perché lavoriamo un pH intonato tre quattro
E quindi abbiamo visto che è piatta basico veramente molto poco attiva è pur vero che una certa percentuale di mogli sì l'abbiamo sempre ottenuta abbiamo una ecco perché di globuli rossi intorno sessanta per cento consumando lavoriamo sì anche perché lavoriamo questo un globulo se vogliamo già stressato in quanto quelle dialisi tipo toni calmi creiamo ulteriori poveri quindi è tutto un compromesso tra pori creati da della tossina emolitica pori che vogliamo noi quindi bloccare la formazione di quelli che non vogliamo e poi i fare scattare il meccanismo solo al momento del del bisogno qui non poi dell'Appia caccino
Bene non ci sono altre domande grazie e c'erano alla prossima presentazione che da parte di Rottoli sarà la bussola atti dall'asta che presenterà Gazosa caratteri session o febbraio sei For Trans Pittelli all'inibisce hanno finito i Rizzo Mitri coxa né Production
Dai infiammato risse sì prego
Allora noto che in molte malattie dell'albero respiratorio delle vie respiratorie si verifica un aumentata produzione di questo che è uno dei più importanti mediatori chimici dell'infiammazione che l'ossido a di azoto ossido nitrico
Questa molecola una casa a vita molto breve
Che viene prodotta dalla partirà da Gemina e ossigeno molecolare ad opera di enzima che è l'ossido nitrico sì in casi di cui sono nate tre isoforme tue costitutive che sono quelle indotte viale in ossa e quella neuronale nel nostro
E la forma indurci bile inox
è quella più importante dal punto di vista infiammatorie in quanto è quella che la cui sintesi viene indotta nelle cellule infiammatorie soprattutto dei macrofagi ad opera di citochine infiammatorie o dei ventose tenendo tossina difterica
Quindi è chiaro che
Una strategia terapeutica
Prevede può prevedere l'inibizione della di questa molecola del dell'attività di questa molecola proprio per impedire la produzione di Asturias Giotto in queste malattie infiammatorie
Più che però somministrazione per via sistemica sarebbe molto utile
Poter somministrare questi inibitori Tino sa per via inalatoria ad esempio dato che parliamo di patologie infiammatorie tipo asma
Bronchiale eccetera
Quindi sarebbe appunto utile sulla somministrazione per via are Ario sonica purché questi inibitori siano in grado di raggiungere ovviamente il sotto epitelio listati sotto epiteliali dove ovviamente
Sarà presente la maggior quantità di cellule infiammatorie quindi lo scopo del nostro lavoro
Che fra l'altro è stato finanziato dal CIPE e è stato proprio quello di mettere a punto un un un saggio per valutare la capacità di alcuni nostri venditori di attraversare l'epitelio respiratorie di raggiungere quindi gli strati sotto epiteliali in modo da inibire la produzione di ossido nitrico in questa zona
Abbiamo scelto tre inibitori la il primo è quello più storicamente più utilizzato che la Name che è una un attimino sostituita con un estere sul gruppo c'è un gruppo metilico scusate sulla sul gruppo carbossilico
Un altro inibitore sempre analogo dell'arginina che però a le caratteristiche dell'arginina stessa cioè a gruppo amminico e carbossilico libero
E infine uno abbastanza nuovo che non è un analogo dell'arginina ma un analogo della disegno
Allora è ovvio che tutti questi inibitori come vedete hanno la struttura simile agli amminoacidi cationici e quindi è verosimile che
Siano in grado di attraversare o di interagire con i trasportatori pari a minacce ricatti o amici allora nelle cellule mesenchimali esistono quattro sistemi che sono in grado di trasportare minacce ricatti omicidi ognuno con
Caratteristiche specifiche cioè il primo Licci non più a e l'unico che è specifico per anni una civica azioni ci è stato indipendente ed è ubiquitario
L'unico sistema concentrati Ivo sodio dipendente invece questo bis zero grande che accetta sia amino acidi cationici sia minacci di neutri tipo nelle Ucina in presenza di sodio
Un altro molto interessante questo sistema y più l perché è sodio indipendente per quanto riguarda gli aminoacidi cationici cioè funziona trasporta gli aminoacidi cationici anche in assenza di sodio mentre trasporta che amino acidi neutri solo in presenza di soldi e poi c'è questo che
Completamente soli indipendente sia per i neutri che per
Il vivace di pasticci quindi praticamente noi abbiamo questi quattro sistemi di questi quattro sistemi di trasporto come modello cellulare
Abbiamo scelto una una linea di punto di cellule
Di arrivate da un sia da un adenocarcinoma polmonare che a molto utilizzato nello studio lo studio di trasporto di farmaci che ha la caratteristica molto importante di formare quando viene coltivata sul dei substrati
Due dei supporti permeabili semi permeabili di formare delle giunzioni strette molto molto molto stretti molto chiusa
Che fanno sì che il compartimento apicale venga completamente separato dal compartimento pace laterale cioè formano uno strato continua che non viene attraversato tra una cellula di un'altra ma soltanto attraversa la cellula e quindi è un sistema molto buono per sto per studiare proprio il trasporto tra cellulare di questi eventuali un osso inibitori la parte la prima parte del del nostro lavoro però è stata quella di
Del determinare quali trasportatori fossero presenti in queste cellule dato che non era non era noto in letteratura quali trasportatori esprimessero queste cellule e con questo sistema noi oggi
Aggiungendo arginina radiativa uno alla a livello apicale o a livello base laterale abbiamo potuto caratterizzare il trasporto sia sulla membrana che sull'altra allora
Ma attraverso non non descrivo questi esperimenti perché far vediamo solo a conclusione cioè abbiamo fatto quindi esperimenti di inibizione competitiva sia in presenza che in assenza di sodio
Sia a livello della membrana apicale sia a livello della Baso laterale e la conclusione è stata questa che praticamente a livello dell'apicale noi abbiamo un unico sistema di trasporto
Satura aprile che il sistema sodio dipendente misero grande quindi che trasporta sia cattiva unici che Dell'Utri in presenza di sodio a livello della membrana base laterale
Abbiamo l'ubiquitario sistema y più e abbiamo questo sistema di trasporto y più belle che trasporta amino acidi accattivanti in assenza del sodio e amino acidi neutre in presenza di soldi a questo punto abbiamo studiato
Il flusso tramite cellulare
Di sempre dell'arginina
Molto semplicemente aggiungendo arginina negativa alla livello apicale e effettuando misure a livello base laterale per vedere nel tempo quante arginina passava da una parte all'altra della del Bono strato epiteliale
Con questa tecnica sempre effettuando esperimenti di caratterizzazione in presenza in assenza di soldi presenza in assenza di aminoacidi neutri
Sia al aggiunge a livello apicale sia aggiunti a livello base laterale abbiamo dimostrato questo cioè praticamente il trasporto degli amminoacidi cattiva amici attraverso le cellule dell'epitelio respiratorio avviene in questo modo cioè sia un assorbimento a livello della membrana apicale
Attraverso il sistema Bizzaro grande che è concentrati questo indossate dipendente
Gli aminoacidi poi escono a livello passo laterale attraverso essenzialmente attraverso il sistema y più a valle
Ed escono molto più velocemente se
A fuori arriva del medium extracellulare Baso laterale è presente un aminoacido neutro che può scambiare con l'amminoacido cattiva unico quindi in questo modo noi abbiamo caratterizzato diciamo così il trasporto tra il cellulare
Della degli aminoacidi cattivo amici e a questo punto siamo Ripa ritornati a vedere i nostri inibitore che avevano la struttura degli amino acidi cationici per vedere se erano in grado
Di inibire o di interagire quindi con i trasportati con gli stessi trasportatore degli a minacce ricatti omicidi allora gli esperimenti sono molto chiare perché
Dimostrano che chiaramente la due di questi inibitori che sono lei intende mea e la Neil inibiscono completamente il trasporto tra il cellulare tra tra cellulare dell'arginina
Quando sono aggiuntivi a livello apicale mentre strada stimolano il trasporto faceva una brandina quando sono aggiunti a livello base laterale cioè scomposta ma come un aminoacido neutro partitamente
Mentre la nave non ha praticamente effetto né al quando era giunta a livello apicale né quand'era giunta a livello base laterale quindi praticamente noi possiamo dire che questi due inibitori Landini il Elena permea sono in grado di attraversare il illustrati in uno strato epiteliale interagendo con i trasportatori degli amminoacidi Katia unici la Name che è Dini pittore più utilizzato non è in grado di fare questo cioè non interagisce con le minacce ricatti amici
Questi questi inibitori sono molto utilizzati come dicevo prima e questo dato è soltanto un dato di controllo che dimostra come questi inibitori siano in grado di inibire la produzione di ossido nitrico quando vengono aggiunti
A buono a macrofagi mulini
Stimolati potere del PSE
Allora come cellule produttrici di ossido nitrico abbiamo usato appunto una linea di macrofagi burini scamorza Gerardo sei quattro che produce quando stimolata con l PS una gran una grossa quantità di nitriti
Allora come vediamo tutti tra gli inibitori Name e nel Nemea vinyl sono in grado di inibire questa produzione di ossido nitrico in un modo dose dipendente come noto ovviamente in letteratura
Per vedere però allora se i nostri inibitori una volta che attraversano il monostrato epiteliale
Raggiungono diciamo così la Baso laterale in una forma completamente attiva abbiamo appunto allestito questo saggio che prevede la coltura delle cellule Cannes trenta dell'epitelio respiratorio sul filtro permeabile
E al di sotto invece la linea di macrofagi burini a questo punto abbiano aggiunto i nostri inibitori alle a livello apicale e abbiamo aspettato ventiquattro ore quindi abbiamo aggiunto lei nel PSE sotto ai macrofagi in modo tale da indurre questi macrofagi a
Indurre in osso questi macrofagi quindi indurre una elevata produzione di ossido nitrico
Allora la la la nostra ovviamente il nostro scopo era qual era era quello di stabilire quanto nos inibitore era passato da una parte all'altra del mordendo lo strato epiteliale nelle ventiquattro ore
Allora vediamo il risultato
E vediamo che praticamente va be questi sono se la
Se a livello apicale non abbiamo aggiunto niente abbiamo una grossa produzione di nitriti questa produzione di nitriti è invece molto significativamente ridotta quando a livello apicale noi avevamo la Nm a
Ora mille mentre è molto meno ridotta quando a livello apicale noi abbiamo aggiunto la Narni
Che com'era l'ho visto all'inizio non è in grado di attraverso cioè di attraversare perlomeno tra utilizzando il i trasportatori per le minacce ricatti o amici
Quindi in conclusione noi possiamo dire che infetti le cellule epiteliali sono in grado di traslocare tali da capitale a livello base laterale questi inibitori degli avi non ha della della produzione di ossido nitrico
E in mora e e di dal rendere disponibili quindi per le cellule infiammatorie presenti a livello sottende indotte viale è chiaro che questi nostri obiettori
Devono avere una struttura amminoacidica cioè devono avere un gruppo amminico un gruppo carbossilico libero per poter interagire ovviamente con i trasportatori
Degli aminoacidi Katia cornici
Grazie ci sono domande
Prego
Il valore biotecnologico non si discute ma volevo chiedere c'è qualche altro studio avete dei competitori su questo tipo di alimentazione che voi sappiate G otto Hondo no
No realmente
è una cioè le queste cellule vengono utilizzate molto nello studio e trasporto di farmaci eccetera però modelli di queste modo con culture
O cose del genere non le abbiamo viste perlomeno in in in nell'ambito della Pro del del dell'inibitore del di noci insomma
Per quanto riguarda il trasporto così a livello delle vie aeree mi pare che sia non ci sia niente da dire per quanto riguarda l'eventuale trasporto attraverso altre barriere epiteliali che prevedono che queste molecole vadano a finire nel plasma avete mai verificato se in presenza di plasma
Questi inibitori si recano a qualche cosa che posso impedirlo noi siamo sempre in presenza di Sirmione a cena sempre proseguito gli agenti ogni sera sempre presente una medium di cultura non avevo ormai sono scese sembrerebbe dettagli passaggio in vigore a breve scadenza
No cioè c'è qualcuno che la già aveva già provato ma aveva provato solo con la nave che ovviamente senso del meno fitti fitti efficace
Altre domande
Bene grazie passiamo
Passiamo all'ultima presentazione
Da parte di lanosa Grasso Vilardi che presenterà Rizzo carrelli degna ammetto lusinghiero differential scanner calorimetria of e se c'è il PRP
Un Land prima un prodotte in Sorce INFOR pronto il stabilizzarsi prego
No ora di dieci minuti della vostra attenzione per riferirvi su alcune misure preliminari che abbiamo fatto qui a Catania e riguardano la proteina aprì onirica da criceto
Tenuta mediante tecnologie dal DNA ricombinante
Peste questo lavoro si inquadra in una più vasta ottica che coinvolge Università di Catania
Il CNR
Istituto era le malattie neurodegenerative
E diretto dal professor reclusione in California
Tra le malattie cosiddette conformazionale le malattie prioni che
Hanno la caratteristica unica di e di essere infettive questo
Da un lato accende la curiosità dei ricercatori perché semplificano un paradigma inedito di trasmissione della informazione biologica basato non più su lasci sugli acidi nucleici ma sulle sulle proteine però dall'altro lato contemporaneamente accende degli allarmi
Anche in conseguenza della recente crisi Bellati EBS che è esploso nel nord Europa in Inghilterra qualche anno fa
Riguardo alla possibilità di una diffusione su vasta scala a livello epidermico anche tra la popolazione ma sono le varie malattie ionica e conosciute
Non è noto molto il percorso che porta alla patogenesi di questa malattia quello che è noto però è sostanzialmente riassunto in questa diapositiva cioè la chiave
O le colare di questa malattia e per coinvolto essenzialmente alla trasformazione di una
Ordina che normalmente presente nei tessuti nervosi e non solo nei tessuti nervosi dei mammiferi
E appunto la proteina periodica la cui funzione fisiologica ancora non è del tutto conosciuta e che attraverso una serie di eventi
I testi a oscuri ma che man mano si stanno cominciando a chiarire si trasforma in una isoforma conformazione ammende diversa ma come che non presenta nessuna differenza covalente dalla proteina genitrice e che viene chiamato proteina Screti
Questa transizione conformazionale però conferisce alla proteina
Chiamata così patologica delle caratteristiche biofisica briofite biochimiche totalmente diverse che ad essi associato l'infettività anche se questo punto e
Attualmente a
Attualmente controverso quindi l'interesse
Comprendere queste malattie duplice da un lato
è importante chiarire quali sono i meccanismi per vedete se realmente questa questa novità nella
Nel proporre un nuovo meccanismo di trasmissione di informazione biologia quindi infettività attraverso le proteine e realmente vero
Dall'altra parte però bisogna ci sono delle urgenze
Per potere fronteggiare nel caso che queste ipotetiche ipotetici allarmi di di epidemie da DS nella popolazione umana
Potessero svilupparsi di avere degli strumenti adeguati per poterli contrastare quindi delle
Strategie terapeutiche tra le stretta strategie terapeutiche chiaramente la più
Interessante è quella curativa
E che si basa sulla non solo sulla
Distruzione diciamo così della infezione da parte del del prione del proteine prioni che ma anche necessita di un meccanismo che consenta di riportare allo stato originario i tessuti nervosi danneggiate bene questa questa regia però vedi che abbiano dirla che a almeno allo stato attuale non sembra
Essere altro che un sogno perché
Anche se attualmente si parla di cellule staminali però stiamo parlando di rigenerazione dei tessuti nervosi quindi con Sinatra si network
E quindi questo sembra al momento almeno lo Stato attacco nulla si può dire sembra abbastanza difficile invece più interessanti sembrano almeno più promettenti sembrano essere delle terapie
Chiamate così palliativo meglio terapie che hanno lo scopo semplicemente di prolungare la vita del dell'organismo e che sono basate su due strategie senza da un lato
Bloccare la replicazione del prione dall'altro aumentare la protezione belliche dei tessuti nervosi
Allora ci occuperemo sostanzialmente
No di questa strategia cioè di trovare delle sostanze che siano capaci di inibire la replicazione delle proteine canoniche e in particolare se è vero
Il meccanismo se questo meccanismo dovesse trovare conferma provare delle proteine capaci di poco interagito e con la proteina bionica di rendere sfogo energeticamente sfavorevole questo processo
Allora è chiaro che stiamo parlando di un approccio chimico di un approccio molecolare
è chiaro che anche l'approccio di Nicola i suoi limiti perché faccio per sua natura riduzioni Stival cioè andiamo a se esemplificare in maniera se vogliamo critica il sistema quindi ci allontaniamo parecchio dalla realtà però la esemplificazione del sistema ci rende semplice capire quali sono i fattori che giocano un ruolo
Nel favorire l'anello sfavorire il processo gli obiettivi sono quindi quello di trovare sostanzialmente molecole capaci di
Inibire la trasformazione e quindi di stabilizzare la proteina allo stato nativo ovviamente devono essere capaci anche di attraversare la barriera ematoencefalica
Gli strumenti che noi utilizziamo sono strumenti che principalmente vengono utilizzati per misurare la stabilità delle proteine che sono primis la calorimetria differenziale attenzione è poi anche tecniche spettroscopiche quale di governo circolare in rampa di temperatura che vanno litorale invece Letras trasformazione conformazione
La
Tecnica Calori menti dica
E una tecnica che ci consente di monitorare lo riassumo brevemente di monitorare gli scambi di calore che intervengono in una soluzione protegga quando essa viene riscaldata temperatura controllati in opportuni in un opportuno intorno la strategia e questo ci consente di accedere a tutti i parametri di stabilità termodinamica della proteina in soluzione
La strategia è molto semplice ma vogliamo analizzare dapprima le curve Calori metri che della proteina pura
E poi studiare l'affetto che molecole scelto opportunamente possono avere sulla stabilità termodinamica della proteina Brioni
è stato abbastanza complicato
Riuscire a trovare il diciamo l'optimum sperimentale per potere procedere all'analisi delle curve calorimetria della proteina pura questo perché e questo anche con stato confermato in altri lavori
Se il padre su questo proteine da apparse sul banco Chemistry interamente e la finestra di operatività su questa proteina è molto ristretto
Abbiamo un biacca sei e tre se ci allontaniamo da questo piano grafia borsello abbassiamo se lo ammazziamo otteniamo subito la precipitazione della proteina non solo anche la sua generazione a cui possiamo operare abbastanza bassa quattordici Negro molare se aumentiamo questa concentrazione la proteina anche a piazza sei punto tre
Precipita anche la scelta del tampone eh
Assolutamente cruciale operiamo in tampone fosfato
Capo decina precipita quindi è stato tutta questa serie di
Di prove ci hanno alla fine ha consentito di ottimizzare
Il metodo sperimentale abbiamo ottenuto la curva
Da Lori metrica tutto il i tutti i vecchi che sono positivi stanno a indicare che mentre che viene riscaldata
La soluzione protegga c'è un assorbimento di calore mentre i picchi negativi
Stanno indicare invece un una cessione di calore o la prima cosa che viene
Se osserviamo è una regione in cui ci sono parecchi picchi una specie di struttura fine parecchi picchi molto vicini poi un picco a sessanta gradi che il vero e proprio Folding della proteina e una serie di fenomeni alcuni
Prima
Endotermici e poi grossi fenomeni esoterici ascrivibile essenzialmente all'aggregazione della mattina che avvengono a temperature superiori a cento gradi qui ovviamente stiamo operando sotto pressione perché altrimenti
Non sarebbe possibile
Allora questi questi picchi che non è qui vediamo ingranditi sono da associare
A
Una plasticità della proteina che rende accessibili diversi stati diversi stati conformazionale con energie molto ma molto vicine
Questo quando abbiamo discusso di questo dato con i nostri collaboratori americane loro suggerivano però questo io non sono in grado di
Di stabilirlo al suggerivano che questo potesse essere l'origine
Del diversi strenne anche sintomatologie ci nel progredire della malattia
Ma cosa che abbiamo voluto fare una volta che avevamo tra le mani in questo strumento
Veniva usato quindi per la prima volta su questo va bene è stato quello di confrontare il nostro nato con i dati di di turismo circolare di stabilità della Prodi di nichilismo circolare che sono qui in verde
Che erano disponibili in letteratura che noi però abbiamo ripetuto
E qui ci siamo realmente soppressi perché abbiamo visto che nel caso di misure Calori metriche la temperatura di a un Folding viaggi intorno è il cinquantotto virgola due grammi ed è quindi Aletti operette inferiore alla temperatura diamo fondi misurata con tecniche spettroscopiche intorno ai sessantaquattro gradi questo da un lato ci ha sorpreso parecchio perché
Sta stiamo parlando chiaramente di Protein dissoluzione protegga assolutamente identiche
Quindi ci aspetteremmo una una sostanziale uguaglianza delle due dei due delle due temperatura dei fondi in realtà spesso sta a indicare che il dato Calori metrico
è in realtà più completo rispetto al dato spettroscopio che va a monitorare solo la diminuita concentrazione in alfa eliche
Mentre il dato valore medico è una misura se vogliamo più generale perché va a misurare tutti per le energie coinvolte nella Folding della proteina
E quindi questo ci induce a una più attenta riflessione su tutti i dati che sono stati pubblicati finora sul
Sulla stabilità dell'auto
Dei napoleonica che vanno quindi un attimino magari
Previsti anche alla luce di fenomeni che non siano semplicemente la diminuita concentrazione di alfa eliche
Beh fatto presto abbiamo
Siamo passati
Da un ente a osservare come alcune molecole Sogei non ce ne possono influenzare non solo la stabilità della proteina ma anche la sua
Capacità di aggregare la sua cinetica di aggregazione
Nel caso specifico esiste una vasta letteratura sull'effetto del rame sulla stabilità della proteina benedire che questa letteratura io se parliamo della letteratura
Nel campo biologico ma sì anche per la letteratura
Pubblicato su riviste di pochi minuti con un approccio di tipo chimico bene esistono dei dati abbastanza contrastanti quindi dei dati controverse sull'assetto del rame
Nella stabilità nel nel nell'influirà sulla stabilità termodinamica della protesi
Noi abbiamo effettuato alcune prove a diverse a diversi rapporti molari in rame proteina
E siamo passati da rapporto molare uno a uno fino rapporto molare una tre
E ho potuto vedere come gli affetti sono mammoni molto ma molto diversi a secondo della concentrazione verranno infatti se abbiamo una concentrazione di rame uno a uno abbiamo addirittura un effetto stabilizzante della proteina come potete vedere la curva si sposta a temperature più alte la curva di a un fondo in si sposta temperature più alte
E anche l'aggregazione viene ad essere spostata a destra o se invece che non succede quando siamo in una situazione intermedia quando andiamo documentare la concentrazione di Roma infatti in questo caso l'aggregazione viene ad essere
Addirittura implementata
Beh a questo punto
Abbiamo voluto effettuare anche
Altre misure
Giocando un po'siccome le giocando c'è un po'un jolly allora abbiamo voluto dal ci siamo detti ben visto che abbiamo questo strumento a nostra disposizione
Abbiamo la proteina piani che andiamo a vedere come
Alcune molecole che recentemente sono state utilizzate o per meglio dire sono state testata anche su modelli animali con successo nel trattamento del patologie prima amica
Che effetto hanno sulla curva calorimetria particolare abbiamo studiato l'effetto della tetraciclina sul nell'influire
Sulla curva colorimetrica del primo va detto che la tetraciclina domani gotico poco da dagli anni quaranta
è stato recentemente utilizzato da l'Istituto Mario Negri per è stato pestato di studio Mario Negri ed è stato visto che
Somministrazione di dosi di tetraciclina piuttosto consistenti per la verità sono state si sono dimostrate efficaci nel
Ritardare il progresso della malattia in alcuni criceti infettati
Trattati da malore
Il laboratorio
E al tempo stesso è stato siano esse efficace nell'impedire al problema nell'impedire l'infezione quindi nel prevenire l'infezione
Mai abbiamo voluto trovare questa l'effetto di questa proteina sulla stabilità della
Perfetto di questa molecola scusate sulla stabilità di questa proteina abbiamo visto che in realtà non ha alcun effetto sulla Anne Fontaine quindi sulla stabilità della proteina perché qui come potete vedere le temperature non cambia però c'è un effetto drammatico
Sulla
Sulla cinetica di aggregazione della proteina perché come vedete qui in assenza di molecola avviene un'aggregazione qui addirittura viene praticamente inibita totalmente
Quindi questo diciamo che è in linea con quello che è stato visto all'Istituto Mario Negri
Un'altra un'altra molecola che abbiamo voluto provare è stata il tre Aloisio questo perché
Oltre all'ossia uno zucchero non riducente che non è presente nei mammiferi e che è stato recentissimamente utilizzato con notevolissimo successo nella trattamento della malattia di Huntington senta
Parecchi analogia con la malattia bionica soprattutto perché esse sono malattie che si chiamano da aggregazione mediante polli glutammina ci sono delle sequenze di glutammina tutte vicine
Che favoriscono l'aggregazione che nel caso della malattia di Huntington viene bloccata dal tre agosto bonari utilizzando il nostro approccio ci siamo voluti chiedere che effettua il tre agosto nella
Nel controllare la Folding l'aggregazione del prione abbiamo visto che in questo caso
Rapporti molari di tre Aloisio sono in grado di innalzare la stabilità della proteina e di influire in maniera molto molto evidente ancora una volta sull'aggregazione della protesi
Allora qui a questo punto
Diamo alle conclusioni eh possiamo dire che il nostro approccio combinato Didier se ci dice dice di ci dà una notevole messe di informazioni sulla prima di tutto sulla stabilità
E soprattutto anche sulla sulle capacità di aggregazione della proteina se sottoposta a
Riscaldamento Terni questo ci ha consentito di di densi are come il rame anche in accordo ai dati di letteratura pubblicati finora può disse può agire in maniera differente sulla stabilità sull'aggregazione della proteina
A secondo del rapporto molare proteina metallo con cui viene in cui viene aggiunto alla pronti la tetraciclina
Sappiamo che inibisce l'aggregazione della ordinazioni da ma non influenza la stabilità Haendel tremava ossia un effetto duplice perché inibisce l'aggregazione ma aumenta la stabilità del prione
Chiaro che questo approccio
Calori metrico ben lungi da poter fornire delle indicazioni specifiche su quali farmaci adoperare per il trattamento delle proteine delle malattie prioni che però si propone come un valido diciamo First Ord screening Draghi screening perché e molto veloce
Quindi può consentire di analizzare una serie molto grande una libreria molto grande di molecole che potenzialmente possono avere un'attività anti bionica per poi passare a una fase più raffinata con modelli più vicini palla agli organismi grazie
Grazie ci sono domande chiarimenti
Questo tipo di indagine si applica alle proteine primo amiche o può anche essere attuato peraltro così malattie di degenerazione a Mila no i testi
Allora il problema è che la proteina per poter essere analizzata con questo approccio
Deve essere una proteina globulare cedeva avere una struttura per esempio nel caso dell'altra si nuclei in A nel Parkinson non posso fare non posso utilizzare questo approccio perché questo proteina è Gian fondata di per sé una native Liam Fox del proprio quindi sottoposta riscaldamento no no dei fenomeni termici evidenti quindi non non posso analizzare assolutamente in questo senso lo stesso vale per l'Alzheimer
Mentre mini riprometto invece per la parlanti intona di potere fare qualcosa caso dovessi riuscire a procurare proteina quella in quel caso si può fare
D'ufficio e l'approdo il priore invece Sempione Ilarione non è a una struttura né con quello più utilizzato io forse questo è sfuggito
E ottenuto da tecnologie del da DNA ricombinante quindi manca di di molti pezzi cioè non è una vera e propria proteina
Come la troveremmo nella cellula perché anca dell'Angola
Di Chirico fosfati divino si toglie consente di stare attaccato alla membrana manca degli zuccheri
Tuttavia è necessario eliminare questi diciamo questi tra virgolette elementi questi gruppi perché altrimenti ci sarebbe un elevatissimo in solubilità quindi non potrei assolutamente e ripeto è sempre un approccio semplificato che però consente di avere un primo un primo screening di molecole che in ogni caso se destabilizzano un modello semplice a maggior ragione destabilizzano modelli più
Altre domande
Nulla
Bene allora grazie ancora voi e chiederei professor De Marco di chiuderlo benissimo allora io desidero ringraziare tutti coloro che sono intervenuti coloro che hanno presentato risultati
Auguro a tutti una felice serata e certamente non sarà