I Mostra Convegno internazionale sulle biotecnologie. Organizzato dalla Fiera di Genova, in collaborazione con il Centro di Biotecnologie Avanzate (24-26 maggio, presso la Fiera internazionale di Genova, Piazzale Kennedy, 1)

Vorremmo cominciare ma prima di cominciare dobbiamo decidere se facciamo questa sessione in inglese o in italiano
Questo in qualche modo ci aspettavamo il problema è se c'è qualcuno che ha il problema opposto che non è in grado di capire Netanyahu
Ist Pistarelli One coda Sunsplash italiani in denaro
Trio hard simultanei Sunsplash ad aver largo
Ok
Qualcosa
Ricordo
Questo non c'è dubbio
Adesso inizio donando il sistema Italia amplissime crea cloud le no Adaloaldo fashion Costantini Caliandro e new beccato il terreni guanto da tre ospiti italiani
Tre
Che Nichetti tra slash ante simultanei Translation Vito stramangiare Tibolla Edward session in italiano
Il KGB simultanei Translation Ardian France
Vecchio
Chi vuol qualcuno di voi l'avete o lodare feconda dalla setta laccioli del San People Fear derivare
Allora
Allora se vi rendete conto per favore che qualcuno vicino a voi non capisce vi siete procurati una una radiolina le cuffie
Delle passate e in questo caso noi facciamo la sezione in italiano per favorire la maggioranza
Ok
Allora questa è la sezione di terapia genica di un meeting molto movimentate visto solo la parte in televisione e quindi non sono in grado di fare commenti sul resto oggi la sezione
Su un argomento che benché molto dibattuto dalla comunità scientifica benché abbia attratto l'attenzione dei media in questi anni e non lo ha certo come la parte relativa agricoltura che abbiamo visto in questi giorni
La sessione dedicata alla terapia genica e quindi l'applicazione sull'uomo di tecniche il trasferimento di geni naturalmente per scopo terapeutico lo dice il nome stesso
La sessione a quattro spicchi sì il professor Parmiani me stesso ci sono Claudio Bordignon il professor Palù il professor Naldini Giorgio Parmiani dell'Istituto nazionale dei tumori di Milano
Forse uno se non il più prominente immuno immunologo dei tumori in Italia non dico da quanti anni lavora su questo argomento perché altrimenti ripeto alla sua età che non dimostra Giorgio oggi ci parlerà di una diciamo nuova nuovo Twist nuovo tram che ha preso l'immunologia dei tumori nell'ultimo decennio è ancora di più nella seconda metà degli anni Novanta che ha poi avuto la definizione un poco non bellissima diciamo di immunologica interno affine e cioè l'uso per trasferimento di geni per aumentare l'effetto immunologico il potenziale immunologico dei tumori in modo tale rendere il tumore rigettate le come un tessuto estraneo
Giorgio
Grazie a grandi rappresentazione
Io inizio con una diapositiva che da qui vedo ma la pena
E che mette subito in chiaro di che tipo di terapia genica stiamo parlando stiamo parlando di terapia genica delle cellule somatiche
Non delle cellule germinali naturalmente
Dice anche questo ed è positiva che ci sono due grandi motivi per
Fare terapia genica
Uno è quello di utilizzare le cellule prelevate dal paziente
Coltivate in vitro
Poi modificate attraverso il trasferimento di un gene in queste cellule queste cellule quando sono modificate dopo tutta una serie di procedure destinati a valutare la sicurezza del trasferimento nell'uomo vengono poi re infuse
All'interno dall'organismo dei malati quindi questo approccio si chiama ex vivo
Vuol dire che si perdevano le cellule si trattano pozioni infondono c'è poi invece un altro tipo di approccio un'altra strategia
Che e stiamo in vivo allora in questo caso direttamente sino a cura del paziente
Il vettore che naturalmente contiene i geni che ne vogliamo trasferire vettori sapete presenterete parlare più avanti da Nardini possono essere virus possono essere invece lettori non virali
Può essere del DNA oggi siamo in grado di trasferire anche DNA plasmidi Co direttamente nell'organismo quindi queste sono le due grandi categorie di terapia genica ripeto delle cellule somatiche e quello di cui parlerò io sarà soprattutto la terapia genica dei tumori utilizzando l'approccio ex pivot
Avanti
Quello vi faccio vedere qua e l'approccio ex vivo immunologico come diceva prima professor Bordignon vuol dire utilizzare tutte le tecniche per modificare cellule del paziente sia cellule tumorali sia cellule normali
E può avere infondere in vivo in modo temere una risposta contro il tumore cui possiamo distinguere due modi di fare questa terapia uno è quello della terapia immunologica adottiva cioè trasferire nel paziente linfociti soprattutto altre cellule
Immuni
In modo da offrirà paziente la capacità di distruggere proprio tumore
Oppure può essere una terapia attiva immunologica attiva o vaccinazione
Che si può fare in diverse maniere qui ci sono degli esempi
Da modificare i linfociti T vuol dire tumori il trait info sites linfociti prelevati dal tumore paziente possono essere modificati in vitro inserendo geni di citochine esempio cui Rauti n f
Questa procedura che è stata iniziata alcuni e bachiani fa darsi però sembra negli Stati Uniti
Si è rivelata non particolarmente efficace per quanto riguarda questo genere di Thiene F. stata praticamente abbandonata ma era un modo per cercare di conferire ai linfociti del paziente una maggiore attività cito tossica nei confronti dello stesso tumore
Oppure e ne parleremo un po'più alla fine da questa mia relazione si può trasferire nei linfociti un gene che codifica per il T sarà la Sector chi sarà setto recettore dei linfociti T come dice la parola che prende i linfociti T capaci di vedere uno specifico antigene e quindi quello che si vuol fare si sta cercando di fare attivamente è di trasferendo in IFO citi di un paziente dei geni che consentono poi questi rinforzi Croatia riammessi non l'organismo di riconoscere in maniera specifica la cellula tumorale possibilmente distruggerlo
Un altro modo un po'più complicato e quello invece di costruire sempre in questi linfociti dei pazienti un recettore chimerico
C'è un recettore che utilizza in parte questo recettore sinfonici TT di cui parlavamo
Ma gli conferisce una specificità la specificità attraverso un pezzo di anticorpo noi single Chen si chiama Afp è un antico ha un pezzo di anticorpo che riconosce sappiamo giace capaci di riconoscere anche lieto morale
Loro si ibridi Ytzhak con quella parte del recettore che era questa che capace di trasferire all'interno del linfocita T segnale per attivarlo quindi questa maniera si può fa diventare un linfocita capace di riconoscere degli antigeni molto diffusi nei tumori
Qua ci sono degli esempi ci sono poi delle modifiche che gli sono state apportate di recente a questo il tipo di approcci e andiamo alla terapia attivare esempi di questo genere sono la trasferimento di citochine
O di molecole Corradi sette uno sono molecole importante potesse immunologico vedremo poi nelle cellule tumorali o di usare può le cellule tumorali irradiate naturalmente per immunizzare paziente quindi si costruisce un vaccino
Queste è una ipotesi che è stata è stata proposta proprio a Claudio Bordignon utilizzare i linfociti dello stesso paziente che circola nell'organismo
Dopo aver inseriti questi linfociti un gene che codifica per un antigene del tumore infine questo l'approccio più diretto
Utilizzate di Pasolini che portano un DNA di una molecola estranea alla paziente questa molecola estranea codifica per una proteina Callea che viene riconosciuta la paziente come fosse un autotrapianto
E viene il cellula che ha avuto inserito questo genere viene dei viene considerato come sta organismo rigettata quindi quest'anno terapie che si può fare soltanto inoculato nel tumore stesso
Il l'IPO so ma che porta a questo tipo di Siena io mi concentrerò soprattutto su vaccini costruiti con cellule tumorali tradotte congegni di citochine o DB sette perché questo è un po'l'esperienza che abbiamo fatto nel nostro istituto
Per riassumere moltissimi lavori fatti a livello pre quindi quel clinico
Faccia il suo dovere questo è positiva che è stata disegnata credo da Guido Forni da Mario Colombo
Se l'ho lavorato molto inscenata altri altri studiosi stranieri in questo campo e riassume quello che il meccanismo attraverso cui una cellula tumorale vedete equity
Modificata
In cui è stato inserito un gene di citochine
Può attivare il sistema immunitario questo sono cellule tumorali e che grazie all'inserimento di geni citochine producono citochine vedete questi puntini tutti intorno queste citochine attirano nella massa tumorale linfociti Ocello le della Ungaro Citi
Sì allo il sistema immune cellule K vedete qui i CD quattro e così via questo la cellula dendritiche ad esempio queste cellule alcuni queste cielo distruggono almeno una parte di cellule tumorali
Questa parte cerotto maldestro distrutte fornisce antigeni
A lei è cellule dendritiche vedete qui le quali vanno a finire nei linfonodi perché questo loro il loro mestiere
Di portare nei linfonodi gli antigeni qui presentano di antigeni nel linfonodo
Ai linfociti ITT quindi simbolizza nuovi linfociti T sono capaci poi di circolare le sangue arrivare in tutti i tessuti compreso un tessuto tumorale che può cresce la distanza a metastasi
E in questo modo riconoscere l'antigene che avevano prima visto e magari distruggere le cellule tumorali possibilmente tutte le cellule tumorali di una metastasi che cresce a distanza
è stato visto che molte citochine genera questo circuito benefico non tutte nello stesso modo e non ho qui tempo di descrive queste importanti lavori ma il principio fondamentale che la citochina in fa distruggere una parte delle cellule si liberò un antigene
E in una attraverso l'attivazione linfonodo si generano immunità sistemica nei confronti del tumore stesso
Sulla base di questo principio
Non abbiamo iniziato a studiare i pazienti come la nomadi melanoma è un tumore maligno che inizia nella cute dai melanociti cutanei è un tumore che guaribile nel settanta e più per cento di casi oggi anche ottanta per cento secondo le ultime statistiche con la semplice rimozione chirurgica ma quando la chirurgia non è efficace non può portar via tutte le cellule quando alcune cellule se ne sono già andate intorno al nostro organismo
Allora il melanoma metastatico diventa una malattia terribile e difficilmente guaribile
E quindi è molto studiata per questa ragione poi perché
Da molti anni si sa che il melanoma esprime antigeni e che me no ma in grado di indurre una risposta immunitaria come abbiamo fatto noi quello che ho fatto vedere prima prendere un melanoma di un paziente si chiama questo melanoma quattordici nove tra le tue
Abbiamo trasferito in questo melanoma igieniche producono la interleuchina due una citochina molto importante per il sistema immunitario
Poi siamo andati a vedere se questo melanoma così modificato e la più efficace nell'indurre una risposta linfocitaria rispetto melanoma non modificato
E qui vedete uno per un esperimento che indica che ciò e quanto accade
Questo è una cultura mista in cui si mescolano linfociti del paziente con cellule tumorali scambi x salito mossa al calcio
La cultura durava due settimane o quattro settimane e qui vedete che i linfociti Tallo Coldiretti tuona Société all'elfo sites presi dal paziente
Questi linfociti coltivati in vitro con le cellule tumorali
Vedete qua
Non Transpotec col gene ma in cui si aggiungeva dall'esterno ci I l due citochine esogena
E succede non so se dopo due settimane la stimolazione non produceva effetti citotossici sul tumore parentale
Occorrevano quattro settimane provvedere un certo difetto infetto che era inibito solo parzialmente da un anticorpo che blocca la riconoscimento ristretto in classe uno
Qui vedete invece che quando utilizzavamo per stimolare il melanoma tradotto con il gene dell'interleuchina due
Anche se dopo solo due settimane di sera una forte cito tossicità nei confronti del tumore parentale e questa cito tossicità era specifica perché veniva inibita da un anticorpo anti classe uno questo era uno degli esperimenti che abbiamo fatto per provare che illa inserimento del genere va interrotti in A due
Dava un vantaggio dal punto di vista immuno genico di immuno stimolazione al melanoma che avevamo tolto otto e quindi con questo altri esperimenti naturalmente
C'era razionale per cominciare alcuni studi clinici che sono cominciati non solo da noi ma molti altri a gruppi in giro per il mondo e questo è un po'lo schema utilizzato è ancora qui non vi ho parlato note per parlargli del vettore che abbiamo utilizzato un vettore retrovirale
Quarta la procedura che serve per produrre il virus che poi va a infettare le cellule del melanoma che sono state prelevate dal paziente si prevale Cerro si coltivano in vitro come dicevo all'inizio questo l'approccio ex vivo
Le cellule vengono tradotte quel gene che portato da questi virus che vengono prodotti la queste cellule si chiamano Parcheggi in questi virus trasferiscono a Gene e conferiscono quindi la immuno igienicità la cellule tumorali
Di melanoma con questa tecnica abbiamo iniziato questi studi che avevano sotto tiro studi pilota che almeno questi scopi di immunizzare con cellule geneticamente modificate
E capaci di rilasciare l'intero china due-tre Luchino a quattro
Il discorso che facevo prima con la due è stato poi ripetuto pari pari con ritiene dell'interleuchina quattro poi magari potremo discutere perché quindi si tratta di due distinti i protocolli clinici che abbiamo fatto
Anche se basati sullo stesso principio vogliamo vedere se c'è la tossicità dopo i no Kuni multipli di questo vaccino volevamo vedere naturalmente se questa vaccinazione aumentar Nava
La risposta
Si tiene oggi essa è Totò che tenevo Sykes però risposta cito tossica Tine i confronti del tumore e se pure in pazienti che come vedete sono pazienti metastatici stadio avanzato
Sì aveva una qualche evidenza di risposta anche clinica
Questo è lo schema del nostro protocollo Bedetti pazienti schematizzate i con le lesioni tumorali per i pazienti metastatici per i quali non c'è nessuna terapia
Possibile in questo momento efficace presente vero vaccinati ogni due settimane e con uno cinquanta o cento cinquanta milioni di cellule di melanoma naturalmente irradiate per non farle crescere tradotte con i geni delle citochine
E poi in questo prima durante e dopo si faccia tutta una serie di studi immunologici e istopatologici per cercare di documentare la risposta immune specifica al vaccino da parte di questi pazienti
Per far dare un'idea di quella che era la tossicità lato ci sta e questo grande vantaggio di quasi tutti gli studi di vaccinazione che mutuamente
Modesta comparivano degli eritemi lì più o meno ampi nella sito di inoculo del vaccino nei pazienti
Soprattutto quando si macinava con il ci avrebbe la nuova tradotte Coni alle quattro questi eritemi potevano essere anche di dieci quindici centimetri durare per la diversi giorni febbre che durava qualche ora e niente di più quindi una tossicità accettabile di fronte a quella di altre procedure terapeutiche
Cosa succedeva nel luogo di inoculo del vaccino
Abbiamo fatto delle biopsie nel luogo di no con il vaccino vedete io due sette giorni
In queste pazienti inoculato con vaccino che rilasciava interludi fino a due abbiamo visto che c'era Italo china due anche dopo sette giorni di questo importante per ciò che sono irradiate e sono destinate a morire lì nel sito di no lo però anche dopo sette giorni c'è la traccia della citochine
E c'era traccia di un accumulo di un infiltrato linfocitaria o aumentava soprattutto vedette Lucidi
Al cd quarantacinque se vedo bene da qui c'è un certo aumento anche dei CD otto non particolarmente spiccato devo dire ma insomma vedevamo dei linfociti tiene sede binocolo del vaccino questo era una foto di è una colorazione del sito di inoculo ci sono moltissime cellule in fase degenerazione Cerruti melanoma qua
E quando Montedison un anticorpo capaci di vedere IGP cento che è un antigene del melanoma si devono numerose cellule di melanoma ancora abbastanza ben conservate dopo sette giorni in mezzo a molte altre Cerva degenerando
Cosa è successo punto di vista clinico non molto purtroppo non ci aspettavamo molto pochi pazienti è stato devastato come dicevo
Difficili arrivano la risposta ma quello che abbiamo visto che alcune lesioni vedete qui le risposte miste risposta mista significa che alcune lesioni scompaiono altre lesioni non scompaiono
E quindi a segnalare che per almeno almeno alcune tasse possono regredire
Ma ci dice anche queste in termini clinici che il risultato non è abbastanza intere non è sufficiente per proseguire con in studi con un numero più ampio di pazienti
Sia con lei alle due che alle quattro quindi queste osservazioni cliniche
A quelle che noi abbiamo potuto fare dal punto di vista immunologico è importante che capire come dicevo prima se c'è una delle risposte specifiche determinate dalla vaccinazione questo è un esempio di un paziente vaccinato con ce lo rivelano Macrì lasciavano et lux in A due vedete linfociti che prima del vaccinazione dopo la vaccinazione questo è il controllo linfociti solo queste è un test di rilascio di citochine l'interferone gamma che viene rilasciato appunto quando c'è un riconoscimento specifico dell'antigene vedete e confronto questa prima e dopo la colonna bianca ritornava bianco Inoue questo paziente che è stato vaccinato lato istogramma è un controllo positivo
E questa reazione scompariva quando aggiungevamo nel terreno di cultura un anticorpo anti CD treccia anticorpo capace di bloccare i linfociti T
A indicare che l'area la reazione era mediata da linfociti T e che c'era un netto è significativo aumento in questo paziente associato alla vaccinazione aumento nel riconoscimento di un antigene specifico del melanoma
Per quanto riguarda i pazienti vaccinati con cellule che rilascia un solo fino a quattro anche qui abbiamo visto vedete prima la vaccinazione dopo la vaccinazione
Questo è un teste nei confronti del tumore autologo del paziente c'è un netto aumento di riconoscimento con cui il teste rilascia interferone
Anche qui viene inibito la reazione da un anticorpo che si chiama doppioni sei trentadue anti classe uno ai tanti nuovo indicando la specificità della reazione e anche da un anticorpo diretto contro la carriera a due che era la Callea di questi pazienti
Inoltre questi pazienti abbiamo fatto anche un testi a dissi sì
Antipodi da pendente Saito taxi siti
Che quindi è un teste mediato dalla risposta anticorpale ed è noto che lento Luchino a quattro può generare queste risposte rete in questi due pazienti prima e dopo la vaccinazione un etto
Aumento della risposta anche se una risposta di per sé non è particolarmente elevata quindi segni abbastanza chiari di induzioni risposte specifiche da parte del vaccino nei confronti delle cellule di melanoma
Tuttavia
Queste risposte non erano molto frequenti quindi la conclusione di questi due studi che abbiamo condotto qualche anno fa
è la seguente questi studi iniziale impazienti e stadio quattro e sottolineo questa condizione clinica particolarmente difficile
Vaccinati con Charlton scuote congeniti e le due e le quattro hanno portato a queste conclusioni i protocollo clinico era fattibile senza problemi particolari per i pazienti
Né per coloro che hanno gestito protocollo laccio tossicità come fatto vi ha accennato era modesta
La risposta clinica era però confinata limitata a risposte miste nessun paziente a completamente rigettato tutto il tumore
E inoltre la risposta specificati che abbiamo potuto vedere era però limitata a non più del trenta per cento di pazienti circa quindi questo evidentemente ci dice
Che il vaccino non è ancora sufficientemente forte per indurre una risposta più frequente nei pazienti come vorremmo
E allora per cercare di migliorare questo vaccino intanto mentre la facciamo questo lavoro clinico molti studi a livello pre clinico portavano fuori forma sionista e quale quella importante che una rete qui la cellula tumorale
Il potere s riconosciute attivare sistemi immune deve presentare l'antigene uno che ha un pettine all'interno della tasca della molecola visto compatibilità di classe uno ma questa presentazione Diretta non funziona è stato visto funziona la presentazione se c'è una cellula un anti se presenti saranno in genere una cella detritica che oltre a ripari presentare il peptide nelle dall'iter lavora i cori classe uno classe due
Ha però una molecola che si chiama P sette ce ne sono diverse questo molecola capace di dare il secondo segnale signore con stimola torio in assenza del quale linfocita T non si attiva e allora una possibilità era quella di fornire alla cellula tumorale anche questa seconda molecola costi Morante qui vedete
Lo schema che con questa seconda molecola anche la cella tumorale potrebbe essere in grado di attivare direttamente alla risposta linfocitaria
Per fare questo abbiamo qui è un esperimento non fatto da noi
è un gruppo americano che dimostra negli animali come la espressione di questa molecola costi moratoria di sette sia cruciale da indurre una risposta in vivo questo lo studio fatto negli animali
Contro il tumore vedete di sette e la molecola costi materia e sette e l'antigene di questo particolare le vigna
Di tumore Murino questo l'esperimento vedete che quando sino a cura il tumore che non ha l'antigene una di sette c'è crescita del cento per cento degli animali quando sino a cura il tumore che all'antigene sette ma non il la molecola costi moratoria c'è ancora crescita nella cento per cento degli animali o quasi e tuttavia quando si fornisce attraverso la la More modificazione genetica questo tumore la molecola di sette ecco per tumore viene totalmente rigettato dagli animali quindi la molecola di sette
E ce ne sono altre che hanno una funzione analoga è capace di far riconoscere anche in vivo la cellula tumorale indurre una risposta
Immunitaria così forte da far regredire completamente il tumore questo è un modello animale che però da un forte razionale per fare altrettanto nell'uomo Lo di Ahn cominciato a far qualcosa del genere e questo lo studio invito naturalmente l'uomo istruì preliminare se fate che in vitro abbiamo tradotto la molecola bis sette nel numero anomalo
Venite qui l'esperimento in cui si dimostra che il PdL vuol dire linfociti del paziente per i fra Badoglio info sites quando i linfociti vengono mescolati al tumore del paziente non sia nessuna riconoscimento nessuna reazione quando il tumore è stato conferito la capacità di di esprimere il molecola P sette attraverso trasferimento genico vedete una forte stimolazione dei linfociti
Che inedita da anticorpi contro la molecola di sette che vuol dire quindi che cruciale per questa stimolazione e contro gli antigeni di classe uno di classe due perché in questo caso si trattava della popolazione dove ho selezionato di linfociti del sangue periferico che e naturalmente possono lavorare sia attraverso i CD quattro CD otto e quindi spiega questa inibizione quindi da inserimento di questo gene nelle c'ero io che non amo mano porta a una drastica
Aumento nella capacità stimolante nei confronti del paziente
Un ulteriore passo in questa direzione abbiamo oltre del prodotto giovedì sette da ottantotto anche il gene dell'io alle due
Come ho fatto in precedente tutti e due i geni e che chi viene esperimento invito che dimostra che i due geni dando una
Più forte sinergica stimolazione ai linfociti rispetto al trasferimento di un gene solo come si vede in questo esperimento quindi questa ulteriore modificazione della del
Cellule di melanoma umano possono incrementare in maniera significativa loro capacità stimolante
Negli ultimi due minuti volevo farvi vedere attraverso dei lucidi
Riassumervi la parte che riguarda invece la modificazione dei linfociti
Ecco questo è uno schema di tre possibilità attraverso cui macho possono modificare i linfociti la prima riguarda una modifica di cui credo di parlerà in maniera più precise quanto sappia fare io professor Bordignon che serve a eliminare l'eventuale linfociti T che vengono inseriti nell'organismo a scopo terapeutico la seconda l'ipotesi che vi
Accennavo all'inizio
Che è quella di inserire un recettore nuovo nei linfociti vedete questi linfociti hanno un loro recettore noi sediamo recettore che sappiamo capace di riconoscere un antigeni tumorali quindi conferiamo questi linfociti una nuova capacità reattiva
E quindi questo consente di ridire dizionari di Fo citati che trasferito le pazienti può riconoscere e distruggere il tumore e infine la quello vi dicevo che questo all'inizio col questi recettori chimici
Che possono anche loro vi direzionale dei linfociti T e trasferiti nei pazienti favoriscono ancora riconoscimento distruzione del tumore
Per darvi un'idea
Di
Il trasferimento dei linfociti T correttore vedete
Bisogna preclude identificare recettore
Sapere cioè che c'è un recettore dei linfociti capace riconosce quel preciso antigeni
Quindi geni che codificano contiene codificato recettore viene trasferito sapendo che quel linfocita diventerà capace riconosce quell'antigene ci sono degli esempi qui
Che sono quelli gli antigeni del melanoma Marte GP cento oppure l'antigene CEA oppure l'antigene della proteina un congelati cinquantatré concorso persino più cinquantatré
Importante questi generasse trasferiti nei linfociti del sangue periferico dei pazienti cosa non facilissima
E poi si vogliono essere usati a scopi terapeutici bisogna espandere
In un numero considerevole questi linfociti poter Nerino curare le pazienti e dieci alla dieci o dieci alla undici
Per poter avere una significativo effetto terapeutico bisogna cioè esser capaci una volta modificati geneticamente di espandere in quantità
è in vitro prima di poter inoculato in vivo
Ecco cosa quello che ho letto quindi concludo con
Questa
Quest'ultimo lucido
Dicendo che
Che ha concluso molto generale che riguarda soprattutto la vaccinazione abbiamo più parlato
Chiede modificazione che gli ho fatto vedere prima cioè quell'inserire geni citochine d'inserire geni molecole costi moratorie e altri geni che vengono a alla nostra alla luce dagli studi preclinica ci può
Dare una forte
I muri cecità queste cellule tumorali e quindi facile superare alcuni degli ostacoli abbia incontrato precesa e soprattutto far migliorare la risposta clinica mentre miglioriamo anche la conoscenza del meccanismo di questa risposta qui questa manipolazione genica potrà adesso di grande utilità in molti casi di tumori come nella norma per i quali le terapie attuali sono molto poco efficaci grazie
Grazie Giorgio ci sono domande e commenti chiarimenti curiosità
Probabilmente notazioni questo tipo di domande interessanti vengono proprio persone me ne sto tempi interessante perché
Interessano tutti gli altri possono essere comprensivi e tutti gli altri più che una discussione tra
Grazie
La seconda domanda dopo che questi inizia a sinistra sanitaria sedotti sanità iniziano la capacità di enti casse perché è uno dei problemi dopo la transazione è proprio quella segnalasse la capacità di cassa
La prima domanda che molto importante la risposta è sì spesso accade il che le cellule metastatiche perdano certi antigeni
E quindi si teme un tale proposta è stato attivato nei confronti di quegli antigeni presenti o nel tumore primitivo ognuna per metastasi precedente
Non siano più espressi nelle mie tasse del paziente il momento in cui si vaccina oppure c'è una anche una riduzione dell'espressione dentini classe uno che sono deputate a presentare l'antica quindi questo è un fenomeno di selezioni di muro selezioni in vivo che è stato dimostrato che si può verificare
Ed è uno dei maggiori ostacoli parimenti a questo tipo di terapia
Per quanto riguarda i linfociti tradotti qui abbiamo un esperto che Claudio Bordignon non abbiamo esperienza diretta di questo ma certamente il problema della loro moltiplicazione in vitro fino al numero che accennavo esiste anche se si è riusciti a ottenere Monio per certi tipi di pazienti linfociti cioè dei presenti numero di linfociti vicino se non altro a questo coloro che aveva indicato però rimane certamente un problema su larga scala di riproducibilità di questo approccio
C'è un'altra domanda
Mi rendo conto che l'enzima principale delle cellule un grande nell'anno citato ieri è la chiosa in altri la tirosina ci sta all'interno della cellula ma quella è presente in tutti i melanomi tranne quei rarissimi casi di melanomi bianchi
Sarebbe possibile in qualche maniera fare entrare nella risposta immunitaria all'interno della cellula in modo che quello sarebbe controllanti tiene sempre presente
Sì di fatto la tirosina così come altre proteine coinvolte un avvio sintesi di melanina e capaci di generare peptidi
Che vengono poi presentati sulla superficie l'azione melanoma
Esistono descritti già letteratura moltissimi casi di risposte linfocitaria attivi nei confronti di questi frammenti chiamava i tirocinanti che sono presentate celebrano marciarono può essere distrutto da un infusi tant'proprio che presenta questi frammenti all'interno della cellula diventa più difficile anche se non impossibile linfocita T in questo caso il meno adatto ma anticorpi e presso l'americanismo Tabacci utilizzate c'è il problema che qui che la tirosina ASI né nel cielo metastatiche spesso non si ritrova più non presenta più questi pentiti sulla superficie del melanoma
Ce ne sono altre
Una lei a
Volevo solo sapere se vista che dal strinto efficace invito della trascrizione sia del ma di indire una città con spostino a Toyo sia di un la già tutti gli introiti a due sessualmente Progetto sono già stati svolti trial clinici netto
Noi non abbiamo iniziato ancora tra clinico ce ne quanto sapere uno in corso credo in Germania ma i risultati non sono pubblicati
Bene allora andiamo avanti suo turno professor Bordignon del direttore scientifico all'Istituto San Raffaele di Milano
Credo che sia uno dei pionieri della terapia genica in Italia soprattutto per quanto riguarda le malattie immunodeficienza continuato a saltano i promotori di questa disciplina nel nostro Paese
Credo che ci racconterà risultati attuali quanto riguarda questo tipo di ricerca grazie Giorgio
Cioè
Purtroppo la nostra posizione felicissima quindi noi non vediamo le diapositive o per lo meno faccio fatica a leggerle io cercherò lo stesso di indicare in modo che rendere un poco più semplice la comprensione
Oltre all'applicazione di terapia genica che abbia presentato il professor Parmiani cioè la sua associazione con l'immunoterapia dei tumori ci sono una serie di altre applicazioni che storicamente hanno interessato questo tipo di tecnologia
In particolare la terapia genica è nata almeno inizialmente concettualmente dall'idea di correggere un errore genetico già presente nella cellula quindi nella semplice equazione che se una malattia veniva causata dall'alterazione di un singolo gene
Inserire quel gene nelle cellule colpite dalla malattia o vuole almeno in quelle avrebbe dovuto curare la malattia
Poi in realtà per motivi storici pratici per l'esigenza legata alla presenza Alaska alla scoperta la messa a punto di altre terapie antitumorali più efficace i tumori hanno finito col fare
Se non la parte del leone ma la parte principale nello sviluppo di approcci di terapia genica o come immuno cene terapia può avete visto con approcci che va hanno relativamente poco a che vedere con l'immunologia
Io quello che farò oggi sarà a fare un breve excursus di quello che è stato uno dei primi modelli una delle prime in modo reticente con gente che credo sia anche più semplice da comprendere nella nella sua teorizzazione nel suo disegno sperimentale nella sua applicazione
E poi da queste all'estensione ad alcuni altri esempi
Al nostro gruppo come accennava Giorgio Parmiani è stato coinvolto
Più o meno fin dall'inizio della storia della terapia genica
Noi così come alcuni altri gruppi negli Stati Uniti ci siamo tutti dedicati inizialmente a questa relativamente rara anziché rara immunodeficienza di cui vi parlerò tra poco è una malattia congenita
Nelle cui condizioni il paziente a causa dell'assenza di un enzima che questo enzima adenosina terminati non distava spiegare tutti meccanismi ma solo i concetti più importanti
Non riesce a sviluppare un sistema immunitario e quindi di fatto o viene trapiantato da un soggetto normale o può disporre di altre
Terapie efficaci oppure Morris
Il da da questa prima esperienza il gruppo sta facendo anche se non ha ancora portato in clinica una serie di di studi più sperimentali di modelli pre chimici per estendere questa esperienza che è ormai quasi decennale ad altre patologie congenite ed altri modi efficienti ad altre patologie congenite
Ma anche sfruttare
Sta sfruttando questo tipo di esperienza per trasferirlo a una serie di altre immunodeficienza e in particolare oggi farò un breve esempio sulla terapia genica dell'Hayez e
Farò o un altro accenno a quelle condizioni di Moro deficienza che sono associate al trapianto di midollo toccando soltanto in modo marginale l'aspetto della immunoterapia dei tumori
La terapie geniche almeno quella ex vivo e il il professor premiare gli ha spiegato bene qual è la differenza tra la terapia eccessivo ce la terapia in cui si prendono le cellule al paziente si modificano geneticamente
Se ne verifica sicurezza efficace traduzione vitalità eccetera e poi si Rino curano da quella in vivo perché vi farò vedere io e tutta la terapia ex dico a terapie Xinhua naturalmente richiede la possibilità di potere prelevare in modo efficace Champions in modo da non distruggere le le cellule di un certo tessuto modificarli geneticamente in laboratorio P di poter mettere in cultura Harper qualche giorno per qualche ora e poi inserirle nel paziente comprendete quindi che il tessuto bersaglio diventa molto importante se voi pensate di fare una terapia ex vivo con un organo che non è espiantati le impiantabile evidentemente
Il l'ostacolo stesso dal sette all'organo diventa insormontabile
Per questo motivo per la grande esperienza che c'è in clinica nel trapianto di midollo il midollo il tessuto ematopoietiche o cioè quello che produce tutte le cellule poi nella diversa morfologia del sangue periferico del sistema unitario
è stato uno dei primi organi bersaglio
Qui vedete rappresentate in modo schematico spero che si viva meglio di protesta vedere io la cellula staminale matto poi etica che poi differenze nei due linee quello cosiddetto mieloide che poi include tutta una serie di differenti linee Gil così piastrine globuli rossi eccetera e quello linfoide
A diciamo che è parso logico una quindicina di anni fa quando tutto questo settore ha iniziato nell'animale
è parso logico dire se noi modifichiamo questa Cellole impariamo a farlo in modo efficace ci sono un sacco di patologie congenite che possiamo curarli certamente tutte quelle sangue del sistema unitario quindi oltre all'immunodeficienza e che riguarda questa questa linea di destra anche la talassemia per esempio o una serie di altre patologie magari meno frequenti altri emoglobina partire o altre
Patologie simili
Quindi un grosso investimento è stato fatto negli anni prima il laboratorio nel topo con risultati anche rapidamente molto promettenti e poi nell'uomo con risultati assai meno soddisfacenti
Nel topo esistono tutta una serie di condizioni che giocano a nostro favore che di fatto non sono poi trasferibili in modo uguale nell'uomo l'esperienza nell'uomo che è iniziata all'inizio degli anni novanta in realtà ha dimostrato che è possibile
Trasferire con alcune tipologie di vetture con alcuni protocolli è possibile trasferire un gene si è visto in studi di marching che non vi sto a spiegare in dettaglio messo me qui scopo non era specificamente terapeutico ma il ricercatore si accontentava di avere alcune informazioni rispetta l'altra specificità a tracce di vita del gene di di questi tipi di cellule o indistruttibili terapia genica alcuni fatti da noi gli altri sussurra sul cellule staminali midollari altri dal gruppo di conto e di nuovi parchi Manna allo Zen celeste al Children's Hospital
Per
Utilizzando
Cellule staminali da cordone
Sostanzialmente però di fatto di avere dimostrato moltissimo hanno ripetuto risultati simili a un po'o anche un pochino meglio nel tempo quello che si è visto che un conto riusciva tratturo e qualche cellula è un conto e averne la frequenza
La sopravvivenza a lungo termine il contributo tutti diverti li Necci che si è visto nei modelli animali nei nel topo in particolare
E che sta di fatto serve per un beneficio clinico avere qualche cellula tradotta
Non serve a niente se noi abbiamo bisogno che tutte le cellule come stare le cellule siano tra stop
E questo in questi anni non è stato tenuto io non ho il tempo oggi per farvelo vedere ma voi vedete dagli anni qui in alto che un bel po'di tempo è passato ormai da questi primi studi
Grossi progressi sono stati fatti stia nel design'della tipologia di vettori e Naldini ve ne parlerà di un esempio importante che nella
Tecnologia in tutti quei sistemi legati al trasferimento genico ex vivo soprattutto l'uso di
Appropriate condizioni di stimolazione che che sono diventati disponibili in questi anni grazie alla scoperta di una serie di citochine che controllano la replicazione la divisione e la differenziazione
Nelle cellule noto proiettile è stato possibile dimostrare
Che la frequenza in tv e molto in vitro e molto aumentata e quindi tutto questo scenario
Nei prossimi anni potrebbe cambiare in modo sostanziale
Però negli anni passati in assenza di questi miglioramenti la nostra logica è stata relativamente semplice ci siamo detti se tra Sture questa cellula è così difficile almeno in modo efficace è tale che il gene sia poi in tutte queste celle perché non tentiamo di tradurre queste cellule visto che la malattia di cui ci occupiamo è in realtà una malattia solo del sistema immunitario e forse trattore queste cellule più facile in realtà questa ipotesi si è poi confermata
Questa è la storia parallela della tra
Come vedrete tra poco queste sono una lista di esempi per dirvi che dall'inizio degli anni novanta sono stati dimostrati prima la fattibilità nel topo poi il design del trial sperimentale
Poi lo studio clinico che è stato pubblicato nel novantacinque ma che in questi anni continuate di trompe previsti mo'flash di questa continuazione
E poi addirittura l'espansione ad altri sistemi grazie al fatto per l'appunto che questo sistema si era dimostrato più efficace dell'alta ora torniamo alla malattia vi avevo detto che avrebbe brevemente accennato alla prima di queste malattie con la immunodeficienza congenita la mancanza di questo enzima che di per sé non produce particolari guai in una serie di altri tessuti perlomeno non così visibili
Non così apprezzabili etnicamente come l'immunodeficienza
Provoca una interruzione in questo pathway metabolico e genera l'accumulo di un substrato che non viene metabolizzato dall'enzima e quindi si accumula nelle cellule anche se questo è potenzialmente tossico però Anniciello la quello che colpisce particolarmente sono le celle sono infarciti tipo in particolarmente quando queste proliferano
Non è ancora chiarissimo se danneggi non poco anche le cellule prima certamente l'assenza della funzione chi non permette in ogni caso lo sviluppo della funzione be appropriate quindi sì all'immunità atti quindi l'immunità cellulare che l'immunità bicefala degli anticorpi viene persa questi pazienti se non sono trapiantato dicono donatore appropriato morivano
Prima dell'età di Duane intorno ai due anni di sparito non sviluppano infezione nei primissimi mesi poi quando iniziano infettarsi diventa rapidamente incontrollabile
Era abbastanza logico quindi che se quelle la cascata di eventi l'idea di inserire il gene vedete qui due vettori dispiego tra un attimo perché nelle cellule del paziente poi introdurre il per le cellule del paziente da correggere tutta la cascata di eventi se la mancanza del gene causa tutta quella cascata inserire il gene corregge tutta la cascata
Ricordate che vi avevo detto che le staminali midollari grandi fisiatra sedurre quindi noi abbiamo usato un vettore per le cellule midollari e un altro anche se identico ma riconoscibile per i linfociti
Questo con lo scopo di dare entrambe le popolazioni ma ma con la possibilità di distinguere molti anni a distanza e lo possiamo fare ancora oggi su pazienti in oculati nel novantadue quindi questo in parte risponde anche alla domanda
Di prima se queste c'era una volta in cigno evitate campano campano moltissimo addirittura molto di più di quanto ne intravede estimo
D'altronde finché non si inserisce un gene
è molto difficile sapere quanto una cellula quella cellula Campa
Quando una il gene dentro la posare perseguita nel tempo
E allora quel gene che di fatto è questo gene qui il gene dell'Atac porta con sé una piccola bandierina vedete questo pallino questo quadro triangolo
Che vi permette nel tempo anche quando questa cellulare moltiplicato si è divisa e diventata qualcos'altro di riconoscere che è sempre derivata da quella in lista d'inserimento di questo gene in quella cedola
Di questo tipo di vettori non ha avuto il tempo di dirvelo si integra permanentemente nel patrimonio di quella cellula naturalmente non dell'organismo del paziente non di tutte le altre cellule ma di quella Cellole quindi per quanto quella cellula si divida viene poi sempre replicato e mantenuto
Nel tempo quello che non abbiamo potuto vedere nei primi pazienti adesso i pazienti sono mancati questo era nei primi due uno trattato nel novantadue l'altro nel novantatré che nelle diverse linee c'è rilevanti soprattutto nei linfociti
Il Gene si manteneva
Queste capovolta ma il il messaggio essenzialmente lo stesso una limiti in denuncia mi permette di analizzare la frequenza delle cellule ingegneri tirate e facendo i conti vedreste che circa il dieci per cento del cielo di questo paziente erano erano ingegneri posate al dieci per cento comincia a essere rilevante ma vediamo quanto lo è questa e gli studi perché questa era già nel paper del novantacinque
Quella che non vi faccio vedere ma che vi dico brevemente sarà mi auguro nette per di quest'anno sono sostanzialmente la sintesi dell'impatto terapeutico di queste di questa tecnologia in questo tipo di malattia
No questi sono i primi due pazienti però vi faccio vedere il terzo ma stiamo preparando il rapporto in questo momento i pazienti in totale arruolati sono una decina ma gli ultimi sono stati arruolati molto più di recente quindi non sono ancora così informative
A questi sono i primi due pazienti negli alla fine degli anni ottanta era venuto disponibile oltre alla tecnica terapie convenzionali divenuto disponibile questa cosa che si chiama pregata che altro non è che l'enzima bovino estratto dal bovino
Combinato chimicamente con questa grossa molecola che si chiama teche e iniettato come un farmaco questa combinazione indispensabile altrimenti l'enzima estremamente labile nel giro di qualche secondo sparisce completamente dal circolo quindi non può fare nessuna fee
Così modificato l'enzima funziona sta in giro per un po'detto significare Cellule in un modo diverso da quello di fare intima naturale ma raggiunge lo stesso risultato e voi vedete qui che questo permette la ricostituzione della funzione immune immaginate su questo grafico la funzione immune
E immaginate questa ombra come l'area normale
Che è molto ampia per la funzione monetaria varia da soggetto a soggetto la vedete che entrambi questi pazienti non hanno sostanzialmente immunità all'inizio del trattamento e poi grazie al piegata immunità si sviluppa questi due sono abbastanza due pazienti prototipo di questo tipo di terapia alcuni rispondono per un brevissimo periodo e poi la pena
Altri rispondono per un periodo più lungo vedete qui in mesi
Però alla fine quasi tutti perdono la funzione tornano ai livelli precedenti il motivo di questo effetto transitoria è noto solo in parte si sa però che questi pazienti quando sviluppano un po'di immunità si immunità no anche contro l'enzima bovino o contro il Perego contro la combinazione che sua molecola molto grossa molto ingombrante
E quindi di fatto ritornano in uno incompetenti a questo punto grazie alla terapia genica i pazienti sono diventati entrambi immuno competenti
Una delle obiezioni che noi abbiamo sempre avuto è stato sì però
Il però di questa situazione che è vero che queste risposte associata temporalmente solo alla terapia genica mentre con l'enzima non funzionava più
Ma come fate voi a dire che questa è solo la terapia genica e non è la somma di questo che oggi non funziona più ma che c'è ancora e di queste naturalmente dal punto di vista etico non è facile giustificare rimuovere questo effetto terapeutico se non a se non fa guai
Fortunatamente sfortunatamente per il paziente fortunatamente per lo studio in uno di questi pazienti si ci sta c'è stato l'indicazione a sospendere il farmaco per degli affetti fecondare
Grazie a questa sospensione
Quello che non abbiamo potuto vedere è stato da oltre un anno ormai che l'in uno terapia scusate la terapia genica ricostituisce la funzione immune non soltanto a questo livello ma addirittura a livelli superiori
Questo era in qualche modo prevedibile perché di fatto le cellule tra scotte hanno un vantaggio selettivo rispetto alle altre stendo il substrato tossico uccide le cellule che non hanno il gene fa crescere di più e meglio quelle che hanno il gene
Per cui i pazienti che in queste condizioni avevano un dieci per cento di cielo e tradotte sospendendo il farmaco che detto sì filesystem Esterno vanno praticamente al cento per cento e quindi hanno l'immunità
Molto migliore l'immunità che hanno questi pazienti equivalente almeno equivalente alla paziente trapiantato con miglior risultato possibile e voi sapete con trapianti midollo comporta ben altri rischi rispetto a questi e soprattutto la maggior parte dei pazienti non hanno un donatore ideale
Tutta questa esperienza di fatto può essere applicate trasferita ad altre patologie quello che voi vedete qui e quelli che sono esperti di questi sistemi capiscono bene una cellula del sistema immunitario infettata da quelle piccole particelle che sono il giro taccheggi
Il concetto è abbastanza semplice qui noi vogliamo gestione altra iconografia ma non aggiunge molto
Quello che noi vogliamo fare fare esattamente lo stesso che è stato fatto nella terapia genica dell'Ada
Ma cui non inserire un enzima che manca piuttosto inserire una molecola e ci sono moltissimi candidati opere farò soltanto un esempio ma è ha proprio la il valore dell'esempio
Molecole che sono in grado di interferire con il ciclo vitale di accredito e questo può accadere al momento dell'entrata mentre la replicazione una serie di fasi diverse
Questo è un esempio abbastanza banale voi vedete il machinery dei del dire ossia che di che in tutta la fase di trascrizione sporto dal nucleo e produzione delle diverse proteine richiede una combinazione di fattori interni fattori cellulari eccetera
Se in questa cascata di eventi voi infilate dentro una molecola in questo caso è un di coglie non è quello che noi stiamo in realtà disegnando per gli studi clinici che io mi auguro partiranno a breve
La molecola che interferisca con questa fase di fatto blocca la replicazione del virus la molecola o le molecole perché il disegno sperimentare più recente prevede la combinazione di più molecole
Di fatto quello che succede
Auspicabilmente una cosa di questo tipo questa è una diapositiva vecchia di eligible dicono ancora io ero negli Stati Uniti ma il concetto
è rimasto lo stesso se questa è una popolazione identica dicendo elettrico infettate con uno Strand di laboratorio in questo caso oggi si riesce a fare anche con gli isolati
Primari di virus che voi infettate le cellule non ingegneri zattera affidamenti e vedono il virus espandersi fu provocare questi grossi fusioni e distruggere la cultura nel giro di qualche settimana mentre l'altro resiste
Ho di dicevo che questa è una diapositiva vecchia il merito di questi studi è stato dimostrare che questo era possibile il demerito era che se voi aveste allungato la diapositiva di un'altra pagina avreste visto che qui sull'altro muro di fatto la cui questa cultura era uguale a questa c'è voluto molto tempo per trovare le appropriate combinazioni che permettono di bloccare il virus sempre e non di esplodere a un certo punto quindi non solo di ritardare l'esplosione del virus oggi questo è possibile grazie a nuovi geni a combinazione di questi geni
E come vi dicevano e ci auguriamo di poter iniziare gli studi clinici abbastanza presto
Io nostri collaboratori negli Stati Uniti hanno iniziato da qualche tempo abbiamo visto che in effetti almeno le prime indicazioni della sopravvivenza di Cellole ingegneri intatte cominciano emergere anche se non sono state ancora
Pubblicate i primissimi dati vanno presentati alla Mecca society accentrerà Pretender la settimana prossima
Sostanzialmente la stessa cosa finisco
Rapidamente facendovi vedere il terzo esempio di intervento sul sistema immunitario e quindi correzione dell'immunodeficienza gli ha fatto brevemente cenno Giorgio Parmiani prima
Queste sono le complicazioni letali che accompagnano il trapianto di midollo la prima la più importante di tutti è quella che il Cile circa la metà dei pazienti che purtroppo soccombono a questo che è un un presidio terapeutico unico in molte patologie tumorali del del sangue soprattutto nelle leucemie la maggior parte sono infezioni
Il secondo
Killer più importante la ricaduta della malattia entrambi questi fenomeni sono in parte in buona parte controllabili con il sistema immunitario del donatore quanto più donatore quanti più linfociti Tornatore ne diamo tanto più rapida la ricostituzione del sistema immunitario
Tanto più efficace il controllo della leucemia con un cosiddetto effetto del trapianto verso la leucemia grazie al sostegno chi mia che di fatto riconosce antigeni riversi su queste cellule oceaniche del paziente li distrugge purtroppo il lato sfavorevole di questa di questa moneta
E questo perfetto più linfociti voi date a questo paziente i più oltre a riconoscere gli antigeni virali
Ho di altri agenti infettivi oltre i conosce gli antigeni leucemie cit queste cellule riconoscono anche gli antigeni di differenziazione probabilmente dei tessuti sani di attaccano e distruggono
Lo fanno particolarmente con la cute
Con il fegato con l'intestino ma in pratica qualunque organo può essere anche se con frequenza minore colpito da questa reazione è questa purtroppo è a sua volta un killer importante quindi negli anni quello che i gli ematologi clinici tra piantatori han cercato di fare stato bilanciare ed ha rappresentato un po'da questa bilancina
Dhabi di bilanciare gli effetti desiderati gli effetti non voluti
Riassunti un poco in questo modo se voi date il numero ideale di linfociti e la giusta combinazione di immunosoppressione per rendere il trapianto per fare attecchire il trapianto poi ritrovate in questa fase di equilibrio tra la Graffer sospesi stia eccetera del paziente la ricaduta leucemie con la ricorrenza delle infezioni che pure ucciderebbero il paziente
Se siete qui in mezzo avete fatto il vostro dovere in modo ideale
Negli anni settanta ottanta all'inizio degli anni ottanta quando la grava su sospesi se era un problema predominante si è capito che questa malattia era causata dal numero dei linfociti
E si è fatta quella che si chiamava allora una ti stende Prisciano cioè si toglievano i linfociti dal trapianto
Rapidamente si sono compresi anche gli altri affetti purtroppo una quota significativa di pazienti e ricadeva per la leucemia
Siccome la leucemia negli anni ottanta la ricaduta dalle ciminiere espansione dell'uso del trapianto era diventata una problematica molto grossa negli anni novanta si è fatto il contrario tonnellate di linfociti stili
Cura con grande efficacia il tempo di fare vedere tutti i numeri ma sicura con grande efficacia alcune forme di leucemia ma si ricade nella gradasso sospese uscire da questo lutto e noi abbiamo pensato di ingegneri Zare utilizzando l'esperienza che voi avete visto per
Ma proprio uguale uguale costruendo però nuovo vettore ingegneri Tare queste cellule con un gene suicida tale che in qualunque momento e siamo in grado di avere il massimo delle fette Antille un cemento quindi contro la ricaduta leucemie Mastella gradasso sospesi Isa arriva e arriva a circa in una proporzione significativa varia da caso a caso ma rivela proporzione significativi pazienti possiamo suicidare le cellule eliminare anche questo rifaccio rapidamente vedere
Lo il vettore il modello dello studio in pratica il vettore permette di trasferire un gene che ci permette di selezionare tutte cellule Trust dote vedete qui non ce n'è nessuna il un rendez trasduzione questi selezionano
E tutte queste cellule avendo questo marker di superficie portano anche il gene suicida perdette la potenza di questo genere in presenza di Karzai proviene dall'approdo vaga cosiddetta non succede nulla nelle cellule normali nelle celle non tra stoffe ma le cellule tradotte trasformano questo protragga la molecola fortemente tossica uccidono la Ciaccona quindi un efficacissimo gene suicida
Questo è stato lo studio clinico
Che è stato pubblicato come riporta iniziale nel novantasette ma che sta continuando e che ha accumulato un numero ormai importante di pazienti in caso di ricaduta Lecce mica
L'unica terapia che si fa è questa con la cellula ingeneri entrate in pratica si richiama il donatore in ospedale si prelevano le cellule si ingegna evitano Sisto lezione hanno solo quell'ingegnere intatte quelle importanti di Entente perché lei non in generalizzate non sarebbero sottoposte
Alle fette del gene suicida
Nel cielo ingegnere intatte vengano curati e poi andiamo a vedere cosa succede se c'è la remissione bene se c'è gran verso so stesi su il protrarsi e vediamo se possiamo tenere sia la remissione della gran verso sospesi
Che il mantenimento della risposta anche gli uccelli queste sono appunto le condizioni
Questo è in summary il livello di attuale già un po'vecchia ma rappresenta non molto è cambiato solo tutti i numeri sono saliti diciamo che su questi ventiquattro pazienti infusi quindici sono valutabili otto purtroppo sono morti nella fase precoce questi sono pazienti con la mortalità altissima fate conto i pazienti che ricadono come sono questi
Hanno meno del cinque per cento del probabilità di sopravvivere quindi cinque per cento meglio del cinque per cento il vostro punto di riferimento
Questi sono morti precocemente questo era inno follow up troppo breve al punto di in cui questo studio è stato fotografato quindi quindi c'era vano valutabili sei hanno ottenuto una remissione completa quindi poco meno della metà
Cinque una remissione parziale che mi ha permesso di continuare il trattamento alcuni sono poi passati nella remissione completa
Solo una porzione piccola non risponde per niente quindi rapportate questo numero quattro su quindici al cinque per cento che vi dicevo prima
E quindi una terapia almeno in alcune situazioni estremamente efficace ma non solo per la risposta anti leucemie cade ricordate che avevo parlato della ricostituzione immune questo un paziente che stava sviluppando un'infezione da citomegalovirus un virus killer
Di questi pazienti infuso di queste cellule ha visto la risposta immunitaria che era a zero e la presenza di inferociti salire rapidamente
Tutti i linfociti erano il CED inferociti ingegneri Tati vedete il cd tre identifica tutti i linfociti questo Marche linfociti Cannistrà astiene
E vedete che con la comparsa di linfociti l'infezione virale immediatamente è stata che li abbiamo anche documentato che queste cellule contenevano le cellule specifiche per la risposta contro il virus
Vi faccio vedere un caso solo
Per dar vita alla potenza della tecnica questo un paziente che purtroppo insieme alla risposta antitumorale antinquinanti leucemia stava sviluppando una gradasso sostituisca amorosa questi sono i livelli di bilirubina gli enzimi epatici
A questa velocità di salita un paziente vai Nacci utili per sedere perde il fegato nel giro di una settimana o poco più
Consolo gene suicida tutte le cellule sono state eliminate anche gli enzimi sono tornati normali
Questo è la conclusione di tutto quello che voi avete visto credo di aver finito qui sì grazie
Se Claudio questa vanno revisione ci sono domande io commenti
Salvini
Ma la terapia genica dell'HIV inoltre quali pazienti pensate di reclutare per questi istituti ad esempio quelli che hanno fallito zeta martella la terapia chimica
Sì allora quali quali molecole purtroppo siccome abbiamo un parte industriale superava sono vincolati per quanto riguarda lo studio alla segretezza ancora per qualche giorno
Di fatto però le molecole sono molto diverse e quella combinazione che viene usata non contiene nulla di straordinariamente nuovo quindi sono molecole anti senza più o meno lunga e si è visto che la estensione dello stress avanti senza finiva con l'avere una grossa importanza rispetto agli studi iniziali ci sono tra dominante come Ratan tempi certi
Trust dominanti negativi ci sono di CODISE eccetera credo che rispetto alla di non di non di Longare segreto se dico che i piccoli scrive all'inizio della storia come era va come Tare eccetera sembravano molto promettenti
Sono poi molecole sono progressivamente sparite avevano hanno grande efficacia su alcuni strenne zero su altre
L'altra domanda la sezione di pazienti questo non è un aspetto tre viale il la compagnia che ha sviluppato questo negli Stati Uniti ha fatto tre-quattro trial divertita
Il così detto trial più aggressivo cosiddetto restio cioè pazienti molto avanzati addirittura con linfomi sottoponibili a trapianto di midollo per i linfomi express estremamente aggressivi
Distruggere tutte Cello epico a combinazioni chemioterapia di terapia antivirale
Ingegnere Zare il trapianto era impiantarle io credo che sia un intervento veramente troppo aggressivo ed eroico credo che Allo stadio in cui è la terapia classica terapia farmacologica antivirale
Per Light oggi sia indispensabile selezionare i pazienti resistenti per qualunque motivo
E che però abbiano ancora una preservazione del sistema monetario accettabile e che non richiedano interventi terapeutici troppo tossici per cui la nostra preferenza di sapere che cosa
Però autorizzata naturalmente la nostra in versione finale nostro preferenza e per pazienti che abbia che caschino alla categoria dei resistenti ma che abbiano ancora una
Presenza di CD quattro idealmente superiore ai quattrocento ma non inferiore ai duecento
Prego materie ritenuta disposto già l'ho avuto la mia domanda in questo ultimo dopo l'intervento comunque Robi una domanda di questo tipo su pazienti io Claudio termico trattanti
Qual è la tempistica per l'eventuale possibilità di inserimento tutte le piogge mica
Questa è una cosa molto bella è una cosa di cui noi siamo particolarmente orgogliosi diciamo tra virgolette perché abbiamo sempre insistito sull'aspetto che al di là del principio terapeutico quindi la possibilità di preparare dei coloni per esempio anti citomegalovirus quanti leucemie CE
O come è stato fatto contro il lidi Teater trattare i linfomi BT dipendenti che sono molto relativamente frequenti nei trapianti di midollo soprattutto in quelli parzialmente compatibile nelle condizioni profonde mono soppressione
Quei sistemi sono incredibilmente Camber somma richiedono moltissimo tempo sono molto costosi eccetera questa tecnologia che voi avete visto brevemente cioè la combinazione di un marker di superficie con il gene terapeutico
Permette in realtà di trust dure le Cellule in qualunque momento serva non c'è nel momento in cui la patologia si presente non prima
E in un periodo di tempo relativamente breve nel giro di qualche giorno quindi nei tempi terapeutici oggi il limite è ancora quello di tipo regolatorio c'è una volta che ho preparato le cellule potevo sottoporle a un teste per la sicurezza così esteso
Che rischia di farmi perdere il paziente nel frattempo ma sono sicuro che via via che
Altri sistemi di test per testare per esempio la presenza di un tiro sempre ricombinante o alte verranno accettati con per esempio la comminazione asseriti c'era e che può essere sviluppate ci qualche giorno hanno richiede i test culturali virale che richiedono un mese o più sono convinto che queste diventeranno tecniche importanti anche scomode uso generale
Naturalmente a meno che la tecnologia dei vettori sviluppi in modo così efficace che ne possiamo direttamente in oculare un tiro sin vivo un info tropico che ci permette di inceneriti dare le cellule in vivo e sono sicuro che questo succederà dipende solo da quando
Anche a tutto questo c'è ancora più efficace e più veloci
I
Sì avesse altre due domande anche per lei
E faccia una volta organo memorie previsti ok allora che a dettare avete utilizzato per trasferire in genialità nel Challenge vietate cresciute diretta allora
Che sono domanda utile anche per permettermi di chiari non poco la dura la la tipologia dello studio il vettore sempre un vettore retrovirale le due combinazioni che erano stati usate nel novantadue quella per il midollo e quella per
I linfociti era un vettore cosiddetto double Coppi qui una caratteristica per diciamo due copie del gene
è un vettore che poi nel tempo dimostrato avere qualche limitazione di stabilità e quindi è stato sostituito intorno al novantacinque per gli altri pazienti ma anche per questi da un vettore invece a coppia semplice sempre un retrovirus basato su Moroni
Il vantaggio di questo è che noi adesso di fatto abbiamo tre o quattro pettorina qui mercanti quattro lettori presente che ci permettono anche di monitorare quanto tempo stanno cantando e che funzione hanno Lecce Luini tate nel novantadue perché possiamo distinguere da quelle iniettate successivamente
Che confermano o è la stessa cosa se ce lo possono campare molto a lungo ma anche per avere un'efficacia terapeutica bisogna che la proporzione del cielo e tradotte sì alta
Sì è la seconda domanda è si sa perché ci sono dei pazienti che non rispondono con la ci sono appunto ricadute di leucemia e quindi si tenta la terapia
Si sente beh sì si sa sistemi linea teorica
Ci sono molte correlazioni non c'è modo oggi di farne una vera predizione paziente specificano ci si sa che secreti paziente Good rischi pazienti Bedeschi parziali che vanno in remissione subito dalla prima che metterà dieci rimangono sono due tresche quelli che ricadono
E hanno bisogno intensificazione sono ben Treschè quelli che resistono dirittura terapie cosiddette resistenti sono deve ripetere che questi pazienti o hanno qualcos'altro e cioè una terapia una logica combinata con la radioterapia chemioterapia oppure invariabilmente progredire Anna questi sono i pazienti che hanno quasi regolarmente una prognosi infausta
Probabilmente lo sa ma diciamo che con la terapia di prima linea una leucemia risponde nell'ottanta ottanta settantasette trentotto per cento i caschi quella quota che
Non risponde subito ricade presto a un cattivo rischio
Oggi naturalmente sono partiti tutti quegli studi che ci permetteranno di sapere in futuro esattamente che cosa determina queste qui monitorare il paziente all'inizio di fare subito le scelte terapeutiche oggi si fanno tra i microchip con un sette di geni di decine di migliaia di igiene di qualche migliaia di geni
Su cui poi si possono caricare il materiale del cemento di questi pazienti è l'analisi nel tempo ci permetterà di vedere quel che sono accesi e spenti di farla correlazioni dire questi sono i geni rilevanti
E quindi forse tra qualche anno non solo potremmo pre dirle ma tratteremo il paziente resistente in modo diverso dal paziente stesso articolo certo
Anch'essa
Poca o nulla manca
Il marito a farsi una fiction con ritardo
Allora di presentabili professor Giorgio palude non è straripato va purtroppo l'UE pressione microbiologia e virologia dirige il Dipartimento di Biotecnologie mediche dell'Università Ida diversi anni impegnato una terapia genica soprattutto i tumori cerebrali cosa di cui ci parlerà oggi
Grazie Giorgio voglio prima di tutto ringraziare gli organizzatori
Per avermi invitato qui a Genova avete sentito parlare di terapia genica ex pivot direttori retrovirale
Io cercherò di fare il punto o almeno evidenziare quelli che sono gli aspetti che oggi limitano di più la terapia genica in vivo cioè impiego di vettori
Per con rilascio sistemico in vivo e toccherò i due aspetti principali che sono che riguardano il gin delivery cioè al rilascio del gene nelle cellule nei tessuti che sono suscettibile o o che necessita di tre di terapia genica
E e diciamo il problema della Gina Splash quindi il target in relativo al gin delli vergine Splash un come espressione selettiva in questi tessuti quindi parlerò anch'io direttori in prevalenza elettori retrovirale e cercherò di di entrare in esempi sia di Ginther rapping sull'uomo che a a livello pre clinico quindi queste sono le strategie utilizzate per approcci terapia genica in vivo utilizzando vari vettori
E per direzionare quindi possibilmente iniettare nel circolo per via sistemica direzionare il virus con il gene specifico sul bersaglio
Quindi l'utilizzo di virus ricombinanti che hanno per lo più da altri virus pseudo tali pieno sardo tipizzazione quindi incorporazione di una invano Petrarolo Ago
Con specificità per tessuto sapete che ci sono i virus dell'epatite dell'encefalite eccetera
Molecola ha da torso
Quindi la possibilità di
Incorporare soprattutto nel proteine Esterne dell'involucro del capside anticorpi beef funzionali in grado di direzionare il virus l'approccio seguito in particolare per i lettori adenovirus
Capri in chimico lo stesso approccio altro che chimico e non genetico e l'engineering in particolare l'ingegnerizzazione quindi ingegneria genetica della glicoproteina in particolare dei retrovirus le sue modificazioni in modo di modificare il troppi Isma'alterando quelli che sono le porzioni recettoriali che ledono riconosco replicando qui vedete alcuni aspetti
Non riesco a vedere bene radio positiva quindi la modificazione
Della la sostituzione del dominio che lega il recettore per via genetica vedete sostituendo un'altra porzione che è in grado di riconoscere il recettore quindi un ligando eterologo
In questo caso o aggiungendo la come in quest'altro caso incorporando nella nella molecola chi merita che si aggiunge alla glicoproteina naturale un sito di riconoscimento per una proteasi in modo che in vivo una volta direzionata sulla cellula e quindi riconoscendo recettore specifico questa proteasi IVA
Il nuovo legandole lascia alla glicoproteina maturare la capacità di reagire con il recettore che è anche presente quindi
Di essere lasciare al virus quella che è la funzione necessaria per entrare nella cellula in particolare la funzione fuso genica
Quindi la capacità di fondersi di entrare nella cellula
Quindi questi esperimenti sono stati condotti negli ultimi cinque o sei anni e possiamo dire che oggi ricapitolando quella che è stata l'esperienza in particolare a livello pre clinico possiamo dire che alcune conclusioni le traiamo con una certa direi precisione e cioè che nonostante molti sforzi soprattutto nelle direzionare il rettore quindi tesi al gin delivery
Con modificazioni di Ermes sì abbiamo visto che questo è possibile se tiene invitano riconoscimento dalla cellula ma si perde molto nel trasferimento genico o perché si perde la l'attività fuso genica o altre
Sequenze che sono presenti nella glicoproteina mercato se che sono in grado di traslocare il virus dalla compartimento Endo sommi coi vari compartimenti intracellulari e inoltre si perde o si va a influenzare quello che è il Traffic in chiamiamo la capacità farmacocinetica e di un vettore una volta che questo fosse inoculato inedito
Voglio qui presentarvi alcuni aspetti che complicano recentemente pubblicati su Genova enologiche complicano ancora di più il quadro del target in quando uno voglia pensare al rilascia al delivery in vivo di un vettore
E sono che vettori dentro l'IVA retto virali possono legarsi a una cellula anche una cellula specifiche in assenza delle lipoproteine quindi Nuti con il capside e in assenza di uno specifico recettore
E questa dimostrazione resa possibile dal fatto che diversamente da quello che si credeva possiamo riconoscere i virus attaccati alle Cellule anche con tecniche semplici di mono fluorescenza e qui vedete l'impiego di un vettore
Chimerico un vettore retrovirale che ha avuto la sostituzione sulla glicoproteina sull'Unità SV quindi sulla dico proteina sul dominio Esterno
Con un single Chen antidoti che riconosce una al folletto bagni impronte in una proteina che lega il sfollato che è presente in cellule di tumore dell'ovaio umane quindi vedete questo virus è in grado di riconoscere Cellule positive
Sia che abbia una inverno ecco tropico ANFO tropico o che abbia la glicoproteina con il recettore specifico meglio collegando specifico col single Chen che la direzione ma vedete ecco qui c'è un legame a queste cellule solo in assenza dei virus no vediamo questi puntini fluorescenti e qui vedete la stessa situazione per cellule che sono negative
Quindi il virus sembra localizzarsi sulla cellula questo è un altro esempio su cellule umane vedete sia che non gli diamo una e ve lo sto ecco tropico ANFO tropico in assenza di Angelo il tiro si localizza sulle cellule che sia realmente virus lo si dimostra con questa elettro microscopia quindi dove si controllano questi di questi sono virioni marcati con particelle d'oro
E qui al microscopio con focale la stessa immagine vedete con misurando la presenza del virus sulla superficie con anticorpi antica psichici anti envelope e qui vedete i la colorazione gialla dal merci
Dei due Floro cloni o senza cantano
Queste particelle si possono quantificare introducendo nel sopra natante che contiene il virus infettante delle particelle di latte ex misurate a concentrazione costante
Quindi questo è un legame ad alta allibita come si può vedere da un'interazione che avviene a quattro a trentasette gradi che persiste nel tempo
Quindi un legame che biologicamente significativo
Che è mediato da recettori o da porzioni
Molecolari presenti sulla per l'OPA e sicuramente presenti sulla cellula non sappiamo ancora dati preliminari sembrano indicare l'importanza di Protti replicano ICI presenti sulla cellula bersaglio
Questo d'altronde già presenti in letteratura perché si dimostra che il procicliche mole che il partito che ha nome intorno all'infettivi Italia traduzione di vettori retrovirale
Ma come sappiamo molecole di classe seconda alla ciclofficina o altre che vengono incorporate quando il virus Gemma dalla cellula quindi molecole
Di
Di adesione cellulare possono favorire questo bagno
Quindi non conosciamo ancora quello quale sia la molecola in causa sul versante virale su quella cellulare ma certamente possiamo in questo cartoon esemplificare quella che è la situazione è un vettore retrovirale quindi quella che gli antichi virologi chiamo antichi vecchi virologi chiamavano
Apposizione non orientata come la prima fase dell'assorbimento e quello che avviene probabilmente per virtù di queste molecole presente sulla dallo e di questi recettori non specifici
E poi c'è l'interazione specifica con il recettore che è quella che permette l'entrata nella cellula
Quindi questo fenomeno ovviamente ci fa pensare al problema del delivery
Del gin delivery che cosa avviene in vivo sicuramente se no Ino curiamo sappiamo che i vettori retrovirale tra l'altro sono labili al complemento quindi hanno già problemi di farmacocinetica
Dal canto loro ma cosa avviene in vivo qua allora noi Ino cullarsi in uno di questi vettori sicuramente avremo una perdita di lettori perché ci sarà da un trattino a livello di molte cellule un trapping dovuto a cellule al bagno in uno specifico
Quindi questa diapositiva esemplifica quello che è un polo d'
Il l'oggetto della mia conversazione oggi cioè due esempi di tumori che hanno altamente maligni che hanno sviluppo locale e quella che a tutt'oggi è la situazione del cinque livelli o meglio del target un cellulare e come vedete l'accesso locoregionale rimostro questo Dio positiva perché si tratta di un accesso locoregionale in fossa cranica posteriore me Dante stereo tassi vedete uno degli approcci più difficile un chirurgo non opera in questa situazione
Perché tumori che si sviluppano in fossa cranica posteriore sono considerati in operabili e per la nobiltà del tessuto neurologico e per la difficoltà dell'accesso quindi il target ovviamente si può fare in questo modo
Rimostro brevemente un lavoro che abbiamo già pubblicato l'approccio alla terapia genica l'esile bastò ma utilizzando
Quindi la combinazione di geni sullo stesso vettore un gene utilizzato anche dal professor Parmiani nei suoi studi sul melanoma l'Inter Lucchina due e un gene per il suicidio metabolico di cui avete sentito parlare
La timidina chinasi che in grado di attivare un profarmaco il ganciclovir in un composto tossico
Quindi il concetto era che l'associazione dei due geni
E mutuando questo concetto da esperimenti sull'animale poteva rafforzare quindi il suicidio metabolico indotto dall'attivazione timidina chinasi veramente polarizzazione Ganci CRI
Poteva aumentare le mozioni l'immunologia Niceta del tumore in situ se la presenza di interleuchina due che vedete espressa nel vettore retrovirale la in grado di attirare i linfociti attraverso quella cascata di presentazione dell'antigene e critichiamo dice l'Unicef immuno infiammatorie
Quindi portare a una risoluzione del tumore che normalmente molto esteso e alla tendenza a recidiva Renzi TT sta
Il mostro qui brevemente quelli che erano gli obiettivi di uno studio pilota condotto sull'uomo
Pazienti affetti da Duke stavamo in recidiva già trattati con chemio radioterapia e chirurgia
O con chi Rocchi tutti cori terapia stereo tarsica l'obiettivo era quello di verificare se questo vettore inoculato per via lo locoregionale
Era sicuro ma soprattutto se eravamo in grado di dimostrare mediante un'altra biopsia stereo tarsica
La capacità di trasferire i geni terapeutici nel tumore di verificare che l'assunto cioè all'induzione una risposta in mora infiammatoria in realtà si verificasse quello che vedete qui sono esempi tratti da due pazienti di biopsie stereo tassi che vedete il concerto di Cellule immuno infiammatorie che avete tutte le cellule presenti
Cellule antigene presentanti macrofagi cd tre CD otto attivati quindi in realtà abbiamo visto uno scenario di risposta e anche produzione interleuchina due intra locale che non abbia visto mai nessun tumore
Dio Psi atto non ha iniettato con il vettore retrovirale
Ma cosa accadeva alla Gin transare in questa situazione questo tessuto tumorale e questo è il gene tk marcato in situ
Con un proprio vedete che il vettore si distribuisce all'interno del tumore sappiamo a queste sono cellule tumorali perché sono contro colorate con un anticorpo contro la procedi la proteina C di caviale
Si distribuisce dicevo il vettore ma in maniera alquanto spocchia e cioè in maniera non molto intensa quindi diffusa viaggia nel contesto del tumore anche per alcuni millimetri e cosa interessante vedette è in grado di tradurre scritti l'intenso colore questi endotermica che tappezzano
Il tumore quindi un tumore molto vascolarizzato che ha bisogno di tende per la sua crescita e quindi per la sua espansione all'interno dell'encefalo proprio di un di una fornitura continua di di ossigeno
Di sangue quindi vedete come sono intensamente colorati tra Sgotti queste indotte
Le conclusioni che abbiamo fatto che abbiamo tenuto questo studio pilota parte la remissione o la risposta che tenevamo in tutti i pazienti trattati una risposta
Che era caratterizzata o dalla Lisi dopo somministrazione di ganciclovir oppure dalla condensazione riduzione di volume tumorali anche intorno ai sessanta settanta millilitri
Era la una risposta clinica significativa in un paziente laddove documentata trasduzione nella sede del tumore
Ma
Le conclusione ultima era che questa traduzione era parziale come avete visto e che sicuramente degli affetti i cosiddetti effetti by stende era erano o dovevano intervenire per spiegare sia la risposta che si vedeva la necrosi o la riduzione
Sia il miglioramento clinico quindi questi effetti by spenderlo non potevano altro che aggiungersi a quello che era l'effetto locale la limitata trasduzione del tumore
Quindi queste conclusioni ci avevano o ci hanno indotto a progettare un nuovo studio clinico che è quello di trattare unicamente tumori in recidiva
Con massa tumorale molto limitata al di sotto del centimetro di diametro perché qui avevamo trattato pazienti conto morì superiori ai tre centimetri di diametro è sicuramente vedete questo che il prospetto di tutta la Ginther Ap condotte in vivo sicuramente migliorare il target Inc aumentando il titolo del rettore l'efficacia e possibilmente riducendo la potenziale tossicità questo l'approccio che abbiam perseguito utilizzare un embolo pseudo Taiping sapendo che il dio la Stone ma sicuramente non è suscettibile o molto suscettibile o a una scarsa presenza di recettore ANFO tropico per vettori retrovirale quindi Pseudo tipizzare io vi lo stimolo Oni con una per lo più di virus della stomatite vescicolare o calda di Bonetti o chimica può aumentare la trasduzione e la sicurezza poteva essere la Giunta favorendo l'espressione selettiva mediante una serie rimpiazzato al posto delle arti arbitrale
Quello che vedete qui sono titoli elevati che si ottengono con vettore retrovirale dopo Pseudo tipizzazione e dopo concentrazione
Quindi questo obiettivo è raggiungibile ma anche se concentriamo uno due litri
Ti sopra natante le particelle virali che otteniamo sono sempre relativamente poche se noi volessimo tradurre tumori
Dell'ordine di tre centimetri di diametro quindi dobbiamo limitarci a tumori molto piccoli perché se uno calcola il numero di cellule esso di alcune centinaia di miliardi quindi arriviamo appena raggiungere questi numeri con particelle fisiche di retrovirus quindi il problema della produzione di una quantità notevole difetto
L'altro problema è stato approcciato cioè il target in trascrizionale
è stato approcciato mediante rescia Flo in quello che si chiama rimodellamento della il tirare in tre primo che come sapete viene duplicata quando retrovirus infetta
La cellula quindi raddoppia nel tirare sostituendo una porzione delle Nasser del retrovirus con un Enhanced tessuto specifico
Che sia tessuto specifico lo vediamo qui vedete solo Cellule di Ali sono in grado di essere tradotte e questo vettore l'abbiamo usato tra l'altro anche in un tumore umano cresciuto
Nel topo nudo
Verificandone quindi l'efficacia e quindi la traslucidi Litta con vettori
Che hanno un target in trascrizionale si può ottenere
Il dubbio resta se ne vale la pena perché quello che diamo stato difetto by stendere Indigo sicuramente è anche dovuto non solo all'effetto immunologico
Non solo all'effetto dei ganci trovi ma sicuramente anche l'effetto degli antipodi su quegli endoteline tradotti quindi una deprivazione di supplemento ematico quindi un effetto di tipo Falkland riduzione di apporto di ossigeno al tumore
L'altro modello di cui vi voglio parlare sempre un modello che può essere aggredito dal punto di vista locale per quanto riguarda il target in sono i tumori attirò idee sono i tumori più frequenti in endocrinologia anche se rappresentano solo l'uno per cento di tutti i tumori
L'accesso locale possibile si porta tranquillamente valutare l'espressione del transgene
E quello che sappiamo
De di questi tumori anche se la chemioterapie la Chirurgia efficace
E soprattutto la puri terapia con iodio centoventicinque efficace nel trenta per cento recidiva no e in questo caso succede quello che succede per il melanoma sono tumori e anche localmente molto invasivi e possono portare a morte
Molto rapidamente dal punto di vista della terapia genica delle
Virali con espressione di Tina chinati o p cinquantatré interleuchina due questi sono i geni
Quindi l'approccio di cui gli hanno parlato entrambi gli oratori che mi hanno preceduto il nostro scopo era anche qui sviluppare con target in trascrizionale combinando
L'approccio efficace nelle glioblastoma cioè un approccio combinato immuno modulante col suicidio metabolico
In questo caso le innanzi al utilizzato è una innanzi al della tireoglobulina
Esiste un'alleanza era anche della calcitonina per i tumori del midollari della tiroide quello che vedete è una sequenza di circa cinquecento paia di basi contiene due siti riconoscimento Petty TF uno che è il principale attivatore trascrizionale tiroide specifico
Un sito x due dove Seeley grano attivato ride prescrizionale in particolare degli usi anzi
Anche in questo caso abbiamo rescia folle il tirar
Dimostrato con la crisi reporter
In tumori differenziati scarsamente differenziati
Questo è un tumore un altro citò ma quindi la selettività dell'espressione del transgene
Ecco una cosa interessante questi che vedete sono tre tumori della tiroide questo è un tumore ben differenziato la lenta crescita più di sette giorni il tempo di duplicazione questo un tumore discretamente differenziato
A un periodo medio di generazione intorno ai quattro cinque giorni e questo un tumore anaplastico contempli generazione intorno ai tre giorni
E qui vedete che anche in tumori Ana plastici
In questo effettivamente abbia documentato la presenza di TF uno c'è l'espressione della del transgene a livelli che sono comparabili rispetto alla a quelli che si ottengono con vettori tipo selvaggio cioè con la l'Ltro endogena
Ma quello che è significativo è che in cellule che non sono di origine tiroidea questa espressione selettiva cioè in queste cellule manca l'espressione quando si usa il vettore con lenti allo Sciaffusa
Cosa interessante per quanto riguarda appunto un approccio che si usa oggi terapia radiante interattivi sotto applica che queste cellule rispondono altri SH quindi si usa oggi per il trattamento con iodio centoventicinque ma questo risultato ottenuti in vitro starebbe a significare che in alcune condizioni queste cellule rispondono anti SH quindi potrebbero essere suscettibili di una risposta aumentata anche la terapia genica
Queste invece il vettore che derivato dal precedente con i due geni interleuchina due timidina chinasi
Prodotto in cellule umane Fly tra queste cellule si producono Dettori a titolo discretamente più elevato per quindi qua questo è un titolo normale per un vettore retrovirale
Non sono cloni cellulari possiamo ottenere da cloni anche titoli dell'ordine dieci a La sette comunque un titolo discreto per un vettore retrovirale di queste dimensioni soprattutto questi vettori sono resistenti al complemento e qui vedete
Nel pannello di tumori di cui si è già parlato ben differenziato discretamente differenziata una plastico l'espressione di dei trans Cenni finita finanzi interleuchina due quindi ovviamente si esprime meglio con lenti a lasciar fuori nei tumori che più contengono l'attivatore trascrizionale Ttf uno
E questa invece è la risposta al gran città ovvero una cosa interessante ecco che vedete qui una il rettore si comporta come un vettore diciamo un altare il tuo la sensibilità alle ci cinquanta intorno a uno micro volare mentre cellulare
Non tiroidee no rispondono al vettore collettore con target in trascrizionale
Questo dato per quanto interessante perché si tratta di Cellule Ana plastiche anche in questo caso pure se queste cellule contengono Rivello ridotto di attivatore ti trascrizionale Ttf uno vedete che la risposta eh
Significativa intorno a concentrazioni che dal punto di vista farmacologico si possono raggiungere in vivo e probabilmente qui il discorso si basa sul fatto che queste cellule Annoni indici replicazione molto elevate
Questo è l'asso recito ma vedete che molto poco sensibile
Queste sono le Ila ancora
Poco sensibili questo invece il tumore ben differenziato e vedete nonostante questo tumore contenga tutti fattori prescrizionali e in particolare Ttf uno la risposta non è eccezionale né collettore
Targhe tipizzato nel collettore selvaggio e il motivo evidentemente sta nel fatto che queste Cellular un tempo di duplicazione intorno a sette otto giorni
Quindi per concludere
Sulla possibilità di target in trascrizionale quindi questo è e facilmente ottenibile in rettori retrovirale ma anche in altri settori
è sicuramente utile per limitare la tossicità non specifica in cellule che non siano quelle target della terapia genica ma può limitare l'espressione del transgene devo dire che nel modello della tiroide effettivamente questo non si è verificato si è verificato un po'di più nel modello dei tumori reali
Ma soprattutto potrebbe eliminare alcuni benefici non specifici che possono essere dovuti alla traduzione di cielo endoteliale è chiaro che un vettore che abbia un target in trascrizionale non sarà in grado di esprimere il transgene in questa eccetera
Quindi in conclusione è un targhettino direzione amento cellulare si può ottenere oggi terapia genica in viva principalmente per somministrazione locale di vettori virali o non virale in tumori solidi
Tra questi per la prognosi i tumori della tiroide e le neoplasie cerebrali
Sono indicate per un trattamento con terapia genica perché sicuramente meglio prestò ma la prognosi è immutata negli ultimi vent'anni con le terapie convenzionali e si tratta di tumori suscettibili appunto un approccio o locale e che hanno aggressività locale
Pensare a un delivery sistemico direi a meno che non studiamo combinazioni di altri
Vettori virali o non vitali per i problemi che vi ho elencato in particolare anche quello del legame non specifico al momento direi che è un approccio ancora da perfezionare
Quindi altra considerazione che oltre allo spezzone del recettore specifico quando volessimo fare una terapia Genentech genica in loco lo Stato replica cattivo della cellula target del tumore va tenuto in considerazione credo che Maldini dopo di me di parlerà a rilento il virus il vantaggio che hanno rispetto ai retrovirus
E il trascritte Maltagliati rappresenta principalmente un una richiesta di biosicurezza siamo a Genova e di più sicurezza e abbia sentito parlare ne abbia bisogno questa un addio sicurezza limite limitatamente quindi l'espressione viene limitata la cellula bersaglio e non ad altre cellule importanti però questo elemento di biosicurezza ci può togliere qualcosa dal punto di vista di effettiva distanza volevo ringraziare qui collaboratori nel mio laboratorio Luisa Barzon che si è occupata di tumori tiroidei Roberto buon lavoro
Federico Colombo che neurochirurgo responsabile studio clinico e Andrea Cavaggioni
Che un eros fisiologo con cui abbiamo sviluppato dei lettori estetici per il cervello che non ho avuto tempo di illustrarli oggi
Marco Boscaro endocrinologo ci ha fornito alcuni tumori tiroidei terreni inoculazione in animale Massimo Pizzato
Nel laboratorio di asciutta che uccideva prodotto i dati sui banchi non specifico dei vettori retrovirale grazie
Grazie Giorgio apriamo la discussione prego qui c'è sì al microfono
Arrivando
Tumori cerebrali
E avete fatto una valutazione soprattutto Lucio di questi ultimi dieci anni
Di quello che potrebbe essere sinergismo terapia genica radio chirurgico stereo transiterà in dose singola soprattutto e anzi direi unicamente per quanto riguarda tumori di gran pezzo dell'ordine di uno due centimetri grazie
Adamo l'approvazione del Comitato etico per trattare solo di tumori che erano in fase di recidiva
Che erano stati già trattati con radioterapia operati anche due volte
Quindi era una fase terminale quindi non abbiamo potuto studiare alcun meccanismo sinergico in questi casi combinando l'unica sinergia che abbiamo cercato di studiare è stata la sinergia genica
Mediante l'espressione appunto di un gene suicida di un gene in in mono modulante
Altro in
Semplicemente volevo sapere quante guarda sempre tumori cerebrali il vettore che avete utilizzato retrovirale quanta parte del genoma virale conteneva ancora e se ne conteneva
Sì conteneva lei stia
Il sito
Sì cioè il sito importante per i parcheggi
Quindi conteneva quella parte di genoma che contenute nei classici elettrolitico n duro derivanti da eventuali
Altri
L'altra Giorgio proseguiamo allora lascio la
C'era radio con legno
Concluderà la seduta
Entrando Rinaldini spolverato il vettore
Si prendono tutti grazie della grazie agli organi agli organizzatori di darmi l'opportunità di discutere il nostro lavoro io iniziava il giusto punto dalla constatazione di alcune delle i successi ma anche dei limiti della terapia genica come oggi si sta somministrando anche in vivo di RAI che stamattina abbiamo sentito che in effetti si stanno facendo dei progressi importanti però i sistemi attualmente disponibili per il trasferimento genico hanno anche dei limiti altrettanto importanti ed è su questo fronte che ormai da parecchi anni ho lavorato inizialmente nel istituto Solter in California con internet come Didier Throne poi successivamente forma anche qui in Italia a Smith per sviluppare una classe di vettori che indichiamo come lenti virale
Che potrebbe risolvere alcuni dei problemi del trasferimento genico soprattutto del trasferimento genico in vivo in tessuti non proliferanti dal mio plastici e anche del trasferimento genico ex vivo in cellule come le cellule staminali emopoietiche sono non proliferanti in buone condizioni o se indotte proliferare possono modificare troppo metà biologica
Vettore di questo tipo
Lenti virale sono in realtà un un tipo di vettore
I ibrido che nasce dalla dalla dalla dalla strategia di conservare in un vettore la capacità dei lenti virus nel nostro caso in particolare dell'HIV di infettare i macrofagi cellule che non si dividono diversamente dai dagli on corretto lo virus come quelle di cui avete sito a parlare fino adesso
Incentivi lo sono in grado di infettare cellule che non proliferano attraverso una via di traslocazione del loro genoma nel nucleo
Che utilizza un sistema di trasporto attivo lo stato attuale delle conoscenze indicherebbe una serie di proteine virali che sono presenti in questo complesso che si chiama complesso di poi integrazione che interagiscono con il sistema di trasporto attivo nel nucleo
Vedrete che nel nel corso del mio tolto il illustrò che questa non è tutta non è la fine della storia vi sono anche altri con aspetti di questa via di traslocazione che differenzia no i lenti virus dagli Concorezzo virus ora la nostra idea è stata di di sviluppare dei vettori le lenti virus seguendo la strategia già validata Pavilion corretto virus ricordiamo ci sono sempre retrovirus questi quindi il genoma approssimativamente paragonabile
Ma mantenendo questa questo Tafuri traslocazione nucleare
Poi che i lenti virus però hanno uno spettro ristretto di infezione i vettori antivirali sono ibridi ovvero utilizzano lento e lotta di un altro virus per permettere l'infezione di una gamma ampia di tessuti
Non soltanto come in questo caso il le le il dies di che ci permette un'amplissima gamma di tessuti anche una particolare stabilità del vettore ma anche lo stesso envelope
Della di rosso di Mondonico a un po'troppo ecco troppo o probabilmente anche altri ve lo virali
Per faccio notare che la l'utilizzo di componenti di terra se e soprattutto di componenti minime di diversi vettori
E anche una strategia di che migliora la sicurezza di impiego di questi vettori noi
Non corriamo il rischio di rigenerare per ricombinazione il lenti virus parentale addirittura l'HIV producendo questi vettori perché del genoma dell'HIV noi utilizziamo delle porzioni ridotte come sequenze
Ci sta che anche disco inciso come dire il tiara il parcheggio in seguito al
I geni Gadi Apple che formano il capside vero e proprio ma non utilizziamo la in blocco gli ho detto non utilizziamo i geni accessori che sono critici per la patogenicità in vivo
E nelle generazioni più avanzate non utilizzavano eppure sta per esempio che un gene regolato da trascrizione quindi l'approccio è stato quello negli anni successivi alla originale
Pubblicazione di questo tipo questo tipo di vettura ibrida è stato quello di ridurre le componenti virali necessarie a produrre un vettore efficiente proprio per migliorarne anche il profilo di biosicurezza
Rapidamente vi illustrerò che questi vettori così prodotti di affetti funzionano nella produzione di Cellole indipendentemente dalla loro divisioni in particolare funzionano in vivo dove se iniettate nel cervello di un auditor in questo caso ad un cervello sano dove tessuto
Neuronale don prolifera nell'adulto
Si ottiene un efficiente traduzione di neuroni qui vedete in verde il transgene che colorato con un anticorpo fluorescente quindi Espresso in cellule che anche se prima no in rosso un marcatore né morale
Le cellule che sto esprimono i due marcatori credete in giallo arancio sono i coloni trasporti in vivo e quindi sono cellule
Che ci provano la capacità nuova del vettore lenticolare rispetto a quelli convenzionali o ancora prove orali
è particolarmente importante che questa espressione si mantiene allunga praticamente per quello che sappiamo finora per la vita di questi roditori
In questo caso nove mesi dall'innocuo iniziale notate anche i successivi in cui l'espressione del transgene innescato Betta gale mantenuta e costante nel cervello
Le proprietà che quindi potrà entrasse assumerà dei vettori antivirali sono quelle di non richiedere la divisione della cellula bersaglio certamente dei tessuti che vi ho illustrato come se sul tessuto nervoso vedremo poi anche in qualche altro in generale questo li rende più efficienti comunque dei vettori a un corretto virali nella produzione di un tessuto
Si attiene la l'integrazione stabile del vettore con espressione stabile del transgene soprattutto in tessuti come il cervello dove probabilmente concorre anche una sorta di privilegi immune nelle ne riguarda l'espressione del transgene e non vi sono segni chiari di patologia relativa al detto perché siano stati finora riscontrato
Ora quello che voi oggi discutere con voi sono un po'due dei Front delle nuove non nei nuovi studi che stiamo conducendo su questi vettori il primo e quello che non è detta l'ultima parola sulla costruzione di questi vettori buona parte del lavoro fino adesso come già accennato era andato a renderli più accettabili primo problema ovviamente
E si potrà mai usare un vettore derivato da HIV in clinica si potrà forse usare quando la sicurezza di questo vettore sarà stata aumentata il lavoro degli ultimi tre anni nostro di altri gruppi andata sicuramente in questa direzione come dicevo di ridurre i componenti
Ma la via sicurezza non è solo l'Italia sicurezza e anche nell'efficienza del G della trasferimento genetico nella capacità di avere particelle di vettore efficienti e che con una dose ridotta di parte cioè le permettono di ottenere un elevato per ostruzione in vivo
Ed è su questo fronte che ricorrere discutere alcuni dati i nostri nostri recenti che dimostra come in realtà ci sia spazio ancora per migliorare la performances e l'efficienza delle centrali
In secondo luogo vorrà invece discutere alcuni dati che riguardano la la effettiva possibilità che un sistema vettore di questo tipo possa essere impiegato in modelli di ma di malattia e quindi di Mostar nella capacità terapeutica
Gli ho parlato di migliorare l'efficienza del trasferimento genico le sentenze del trasferimento genico di una particella di vettore dipende da molti fattori
Ma dipende in prima istanza dal disegno del vettore ovvero dalle dal contenuto di sequenze che agiscono in Cis che sono mantenute nel nel genoma del vettore stesso queste sequenze facilitano l'incapsulamento
Il trasferimento nella cella target con la trascrizione inversa all'integrazione
Nel disegno
Dico un obiettore sì ottiene naturalmente si procede come già accennato prima eliminare i geni ovvero le sequenze che producono proteine virali
E a separarle dalle sequenze ucciso a Fincomed nel tirar che invece manteniamo dette nel costrutto di trasferimento
I geni devono essere espressi nella Cello che produce il vettore che deve scrivere tutte le funzioni ma non devono essere trasferiti nella cellula bersaglio
Con questo approccio tutte relativamente facile separare gli Ltro dai geni Galia tolto e che sono separati sul genoma masse alcune sequenze che agiscono Inches
Sì proprio nello stessa all'interno di geni virali la situazione più complessa questo per esempio avviene con il gene Galli e la cui porzione cinque primo contiene parte del del sito di parcheggi in dice di Paganin si estende dalla dalla sequenza leader nel Genet gambe
E quindi dei vettori spesso si mantiene una piccola porzione del gene gadget non ovviamente per esprimere Ganga anche perché non c'è niente vedi infra Inés queste chiuso ma per facilitare un'ottimale Akagi allo stesso modo
Questo elemento che si chiamava il responso element che ci serve di nuovo Inches nel vettore in realtà parte del Colin Fleming
Oramai nel corso del degli anni abbiamo realizzato che nel disegno di degli dei lettori in questo tipo ovviamente tutta Genet Paul
Era stato eliminato dal costrutto vettore mantenuto soltanto nel costrutto di parcheggi in per esprimere in trance la proteine degli enzimi del detto
Nel gene Paul però ed è scritta la presenza di alcune sequenze che agirebbero inciso durante l'infezione virale in particolare la sequenza di siti che ori di che funzione fungono da prime Eros dalla trascrizione inversa ragione inversa
Dei nel retro di Rossi abbastanza complessa ma quello che mi mi importa qui farvi notare e che a un certo punto quando si durante quella che stiamo la sigla Dellas Plast trovando però della seconda
Elica del DNA l'origine di questa di questa seconda strane scusate il più ecco lo rigetterà seconda strane in tutti lettore troverà lì e al livello del tre prima del genoma da un trainare che si chiama un tratto Poli Purini Co
Nei delle la la fa strangolò rigida questo livello poi apre con una assalto poi si trasferisce al cinque prima del genoma e prosegue la sintesi per copiare il il PIL trascritto
In realtà neve nei lenti virus è presente un secondo sito di Frei Mino di origine della Cindy del DNA all'interno del genoma
E più propriamente nel gene Paul
Per cui in realtà la partita arrivata tutto l'inverso dell'MTV oscuro cede con due siti di inizio della flora speranze interiste
E poi mente stermina con una figura di questo tipo in cui vi sono vi è una discontinuità all'interno di questa struttura questo non poteva succedere dei vettori che vi ho descritto perché ripeto il gene Paul è assente dal costruttore Ettore in realtà però la
Queste sequenze con l'analisi mutazione le sono state riportate all'interno del vettore dello SUAP del virus HIV di avere un ruolo della su nella replicazione mutazioni che mantengono l'espressione del gene ma che distruggono
La l'integrità della sequenza Poli Purini Ca'
Riducono la replicazione virale ci siamo dunque chiese se il nostro disegno in realtà del lettore era in realtà limitante poche perché aveva sottratto questa sequenza e quindi abbiamo Ricco Lonato praticamente una piccolo porzioni in pochi poco più di cento basi del gene Ol all'interno del backbone del vettore
Virale ovviamente nella nella nella orientamento senza e in come controllo di orientamento anti sei
E il risultato poteva stanza evidenti che la questa nuova funzione in realtà aumentava notevolmente l'efficienza dice in trance trent'sia considera delle qua nella cinetica di espressione questo il nuovo vettore modificato questo il vettore di controllo
A parità di inoculo direttore sia una molto più rapide espressione del transgene che raggiunge l'atto prima e comunque anche la il livello finale di espressione del transgene naturalmente superiore per il nuovo tipo di vettore
Non questa maggiore espressione del transgene non è dovuta a una maggiore espressione della cassetta
Il a parità di cassetta introdotte l'espressione dei due vettori uguale mai dovuto a una maggiore quantità di copie della cassetta che vengono introdotte da parte del nuovo vettore a parità ripeto di no quello del della particella procedeva in un Saddam in cui si confronta un inoculo uguale di particelle virali qui possiamo dorsale con un saggio i mutanti ematico
E vedete che se il vettore diciamo di routine usato finora questo il nuovo vettore che ha un centro base in più del genere col vi sono da quattro a cinque volte in più copie di di di DNA questo funziona solo se il nuove Ettore Conti era sequenza Polito entrare centrale dell'orientamento cents l'anti senso non funzionerà e come il corretto ricontrolla indicare quindi che la funzione della Della sequenze come previsto ma come funzionario sequenza funziona durante la trascrizione inversa un'altra o in un altro sta stadio intanto gli ho detto no infetti amo con la stessa quota di particelle ma questo vuol dire che noi in in introduciamo la stessa quantità di genoma
Virale nelle file delle cellule sì perché la qualità di RNA che le particelle contengono e la stessa sia che abbiano o no
La nuova sequenza quindi tre particelle sono prodotte in Capps sita tre con la stessa efficienza allora senta abbiamo seguito la trascrizione inverso nelle cellule bersaglio questa e la fase avanzata di di trascrizione inversa in cui si forma la seconda elica del DNA usando dei fine perché amplificano questa struttura
Oppure usando dei prime che amplificano a questa struttura questa è un circolo che o si ottiene per la fusione e la ricombinazione delle estremità delle chiaro
E in realtà un prodotto di scarto se vogliamo così ritenuto finora della Pato e l'infezione il patto direttore porta all'integrazione del genoma del retrovirus nella cellula ma una volta raggiunto il nucleo alcuni dei genomi vengono invece riarrangiati in questo modo non sono in grado di esprimersi non pochissimi per il i geni virali o il nostro transgene vengono in genere poi persi dalle cellule
Il il ruolo di questa struttura però è quella di fungere come il criterio per monitorare lì la traslocazione nel nucleo perché soltanto nel nucleo che si possono formare perché richiedono in Fini come Liqasi re intimidire comminato Nixon nucleare quindi ne diamo amplificato
Sia questo prodotto che questo prodotto per monitorare la trascrizione inversa e la provocazione nucleare dei vettori di nuovo ripeto a parità di no quello iniziale
E con una sorpresa abbiamo notato che non c'era alcuna differenza nell'approccio nella cinetica da trascrizione inversa e quindi anche se c'era un'origine in più
Della Della Strand del DNA in realtà i vettori uno due tre che sono quelle corna del di partenza quello modificato senso è anche il senso procedevano in modo analogo nell'accumulo di prodotti trascrizione inversa
La differenza grossa veniva invece fuori a livello dei circoli nucleare dove i vettori di controllo e invece il vettore in loco la modificazione avevano a che ha la differenza il vettore modificato
Compariva nel nucleo molto prima e in modo più abbondante
E di nuovo questo vale solo per l'orientamento senso questo indica che la l'azione di queste sequenze non è in realtà al livello della posizione inversa bensì a livello della traslocazione nucleare e altri dati che non ho tempo quadri
Di illustrare hanno confermato questa particolare ruolo questo indicherebbe quindi che la traslocazione del genoma non richiede soltanto delle proteine
Come dicevo l'inizio virali che interagiscono con sistema di trasporto attivo della cellula ma anche delle sequenze che agiscono Inches
Che favoriscono questo processo di migrazione
Ma qual è l'impatto di questa modifica su dei target della terapia genica più rilevanti che le cellule in linea con Tino che dello strato lo vedete qua dove di nuovo a quantità analoga direttore sono azzuffate saggia te con diversi tipi di bersagli in questo caso cellule endoteliali primarie
Vedete che rispettavo la traduzione di controllo il nuovo vettore produce una molto più efficiente infezione e anche livello di espressione del transgene come si può vedere in questo modo di nuovo dovuto alla maggiore incorporazione di copie linfociti primari allo stesso modo sia una maggiore espressione e una maggiore frazione di cellule tradotte con uno stesso inoculo direttore
Non appena interessante che questo effetto di maggiore infettività si esplica sia nelle cellule che si dividono che quelle che non si dividono
Non c'è una parte in questo caso fibroblasti primari sono appena mantenuti inattiva proliferazione o introdotta dal resto e con deprivazione di siero
Di nuovo il confronto tra il rettore di controlli e il nuovo vettore modificato sono per un'efficienza di infezioni maggiore in questo caso l'infezione molto efficienti in ogni caso ma notate i ribelli espressione del transgene come sono aumentati a indicare le maggiore copie
La maggiore infezione sia sia entra in celle che crescono che in cellule che sono in arresto
Quindi questo traslocazione del nucleo col e è un fatto e che che importa sia nell'infezione di cellule in proliferazione che no e anche questo non era atteso dall'attuale diciamo visione dell'infezione da parte delle infidi Rossi
I macrofagi per esempio prima io sono un target estremamente suscettibili all'infezione con il nuovo vettore molto meno a con il vettore di partenza a indicare un miglioramento qualitativo e soprattutto le cellule staminali emopoietiche che sono un target importante per questa famiglia di vettori antivirali
Appaiono in questo caso i dati che vi d'uso sia quelle tenuti soltanto con il nuovo rettore ma il confronto e lo stesso come visto in precedenza per una migliore per forma sul mio e per farlo si vede nella levata
Efficienza di infezione con una sola incubazione di cellule che qui sono testati in cultura continua o per formazione di colonie in modo indipendente poi dall'aggiunta di citochine ma soprattutto a sei noi procediamo all'innocuo di queste cellule marcate intoppi Steven o di e poi al saggio della ripopolazione comunque
Con cellule umane dell'emopoiesi di questi topi
Troviamo in periferia che la grande maggioranza delle cellule umane che ha ripopolato è scritto delle varie linee incluse quelle immature ma anche le linee linfoide melodie sono marcate siamo a livelli di ottanta novanta per cento di positivi marcatura di queste cellule convettori antivirale fra già riportata dal gruppo di ferma
Di di Pato Ibra Magna soprattutto e questi livelli di efficienza di trasferimento indicano una effettivo effettivo vantaggio addizionale di queste modificazioni in riassunto a queste l'aggiunta di una Preve sequenza del gene Paul
Ha migliorato l'efficienza e traduzione sia in cielo in crescita attiva che in grotta Arrest in un pannello di celle primarie che sono interessanti bersagli della terapia genica
E il meccanismo e concorrente con la traslocazione nucleare del genoma del vettore e produce una maggiore quantità di genoma del vettore nella cellula bersaglio
Possiamo quindi concludere che la nucleare ha traslocato enucleare e uno step limitante nell'infezione da parte dei vettori lenti retrovirale in entrambe le classi di cellule bersaglio dividente si dividono e no
Questo processo dipende da delle proteine virali come nella letteratura ben noto ma anche da sequenze genomi che che producono evidentemente dei segnali o delle configurazioni permissive per il trasporto nucleare
La il riportare ai livelli del Volta et la capacità del di di di di effettuare questo processo
Ha migliorato da significativamente le la performances dei vettori aumentando l'infettività delle particelle permettendo di ridurre quindi la dose del vettore
Ora l'altro punto che vola invece discutere e se questi vettori funziona quindi questo modo gratificante efficiente come possono essere utilizzati a scopo terapeutico questo è un vettore nuovo come benché avete immaginato
E quindi non è un vettore che sia ancora in clinica la strada alla clinica una strada che stiamo perseguendo con estrema attenzione
Qui vogliamo intanto chiari validarla o come approccio terapeutico e questo è un lavoro che abbiamo fatto in collaborazione con il commenta Claudio Bordignon il il il ticket di Milano anzi Ingram il lavoro è stato fatto in buona parte infatti nella probatorio di Claudio
Abbiamo iniziato a studiare un modello di malattia lisosomiale
Come sapete malattie genetiche molto rare che però nel complesso delle diverse patologie sindromi notte arrivano a una discreta incidenza alla nascita malattie che pure sono malati e drammatiche e che spetta per cui spesso non esistono terapie soddisfacenti
Quello che viene a mancare in queste malattie uno a è uno degli enzimi che metabolizzano lipidi complesso della membrana o della mielina come in questo caso in particolare abbiamo lavorato sulla vetta mette sulla leucodistrofia metacromatica in cui l'enzima risulta Attanasi a e di festivo estiva che si a in conseguenza il sul fattibile sì accumula nelle celle soprattutto della sostanza bianca della mielina perché e il è uno dei principali componenti della come diceva nella clinica una malattia rara per fortuna ci sono diverse forme come molte di queste le forme più precoci sono quelle quei sintomi più drammatici di progressiva degenerazione del sistema nervoso con gravissimi sintomatologia che portavano a non a morte molto presto nell'infanzia e con trattamenti a attuata al momento
Con pochi trattamenti certamente poco efficaci soltanto nelle forme più tardive della malattia vi sono delle venti benefici col trapianto di midollo la principale bersaglio da Mattia sistema nervoso centrale voi potete immaginare che anche se sono disponibili in alcune di queste malattie enzimi prodotti per via ricombinante che potrebbero sostituire quello mancante la somministrazione dell'enzima e praticamente impossibile all'interno del cervello per l'avventura barriera e note incertezze intimato in cefalica lo stesso trapianto di midollo
Può porpora interi popoli popolare i tessuti della periferia ma come cinetica molto lenta queste malattie sono sparatutto quelle precoci a insorgenza rapida e progressiva
Due vantaggi per utilizzarle come modello di terapia genica di malattia di sognare sono questi innanzitutto bassi livelli di enzima possono completamente
A cancellare il fenotipo in coltura ma anche nel nell'uomo di eterozigote portatori della malattia oppure lite mutazioni in cui si è sì a riduzione delle dell'attività enzimatica anche al cinque per cento
Non hanno sintomi quindi è chiaro che in terapia genica ne abbiamo sempre lottare per raggiungere un certo livello di espressione
E possibile pensare di avere efficacia con bassi livelli espressione ma soprattutto l'enzima che viene prodotto da una cellula che è stata modificata o corretta può essere rilasciata rilasciato da questa cellula e catturato dalle cellule circostanti che ne verrebbero quindi probabilmente corrette o cross corrette e quindi possibile estendere l'area che viene corretta da un intervento terapeutico focale per esempio di somministrazioni un vettore attraverso questo poi meccanismi di cross Correctional voi capite che questi due di quei due parametri permettono Arben di pensare a una strategia come quella della somministrazione diretta nel cervello di un vettore
Io metto che funzioni come quello che vi faccio vedere prima lenti virus ricordate quelle immagini all'inizio di quei di quei tratti che si venivano a lungo termine in genere porta la traduzione sarà focale ma noi possiamo sperare di poter estendere la correzione nella del cervello del topo abbiamo quindi prodotto dei vettori lenti virali che poiché esprimono il genere della risultata Asia
In varie combinazioni soprattutto vettori che ne permetta un'espressione più efficiente parcamento di sequenze
Che agiscono dopo la trascrizione di cui non ho tempo di discutere oppure con il vettore bici stralcio Nicoli descritta dottor Palù che permettono di monitorare L'Espresso la prostituzione anche in vivo
Questi lettori funzione senso di restaurare le l'attività enzimatica in cellule che ne mancano in questo caso oli godendo leciti ottenuti da topi che anima inattivazione della linea germinale cioè knockout per l'enzima
E che sono incapaci di metabolizzare il sul fattibile che vedete qua diventano capaci di metabolizzare lo come obbligo dentro citi qual Tietê dopo la traduzione genica e questo è il fatto i topi che vi ha accennato sono stati prodotti dal laboratorio di Diesel Mann e che adesso le ossa di Bondi in Germania anche ce l'ha rese disponibili
Fortemente questi i troppi hanno una pattuglia Fisiopatologia sovrapponibile a quella umana l'enzima manca non c'è metabolismo che sui fatti del c'è accumulo di limpide
Però la il parla il fenotipo che anche questo in parte sovrapponibile e in genericamente più lieve come molti modelli Lorini
Si sviluppa in nel nella tale diciamo adulto avanzata del topo riproduce le fasi iniziali della malattia
Questa è una è una breve in immagini come i topi sviluppano patologia cerebrale qui vedete
Nella in sostanza bianche che se cade la Fimbria la comparsa progressiva a partire intorno agli undici mesi tra i dieci e gli undici di accumuli di ripide metà cromatico che color dovrebbero vedersi in colore rosso a indicare il contenuto in sul fattive questi aumentano sempre più e quali e quante conducono ad annichiliti
Vediamo anche osservato trasognato descritte in precedenza una peculiare degenerazione di cellule nervose in alcune aree cerebrali soprattutto nell'ippocampo a livello di una della ci appare che è una delle zone la Corte ci può campare queste cellule che diventano iper Colorado lì in questo calo col dito lui Dina ma anche con altri coloranti
E che vista ricasca platonico hanno aspetto di Franca patologia concordo mento del nucleo iper iper materiale elettrico intenso all'interno del citoplasma e che appare in perché appaiono del generale come si vede anche fatto dalla netta riduzione di neuroni negli stadi avanzati della malattia abbiamo quindi proceduto a Ignaz in e colare nella zona della fine dell'ippocampo vettore che esprimesse il nuovo l'oncogene sulla te il gene della risultata sia deficitarie in questi topi
Intorno all'età in cui la malattia era manifesto si sta manifestando e poi esaminarli per caratteristiche istologiche visto che e East chimiche a distanza di uno tre o cinque mesi
I risultati dell'iniezione si vedono qui a tre mesi dalla distanza questo è di nuovo l'ippocampo e la Fimbria il detto è stato in che stato inoculato a questo livello
Un po'di carbone è stato messo per marcare il sito di iniezioni in questo animale
Vedete che non vi sono segni evidenti di patologia successiva all'iniezione qui siamo a tre mesi a un mese di distanza si può osservare una reazione flogistica limitata intorno al alla alla traccia del lago che quindi tende a riparare bene
Infiorescenza in questo caso questo vettore aveva e radici sproni casse osserva la traduzione di Cello nella Fimbria di Tito viale e di pace non si vede bene quali neuroni nella ci attrae
La analisi sto patologica dimostrato che nella sede dell'inoculo né e questa è la e l'ippocampo trattato sia una correzione
Significativa della degenerazione dei neuroni che a che in questo caso nella distanza e ben evidente dalla parte trattata in onda la parte controlaterale non tratta
A cinque mesi di distanza però la terapia si estende addirittura data la dalla parte trattata la parte non trattata controlaterale a indicare quindi una progressiva
Diffusione delle effetto terapeutico si vede anche bene con l'accumulo di ripide metà cromatico nella sostanza bianca questo è un è un animale trattato con un vettore di controllo dopo cinque mesi
Questo è un animale trattata con un vettore terapeutico dopo cinque mesi in cui da entrambe le parti del cervello c'è una riduzione molto significativa degli atti questa diffusione delle prima e quindi latita terapeutica nel cervello si è è stata provata direttamente con un saggio intima dico e in questo caso con un saggio non enzimatica in cui il cervello è stato state le ex Cison a uno tre o cinque metri distante dall'inoculo sezionato in quattro sezioni rostro caudali e poi esaminate per rinvia per contenuto delle in fino umano vedete che l'enzima compare nella zona dell'inoculo anche a destra in questo caso infrazioni caudali
A distanza di un mese ma poi appare diffondersi in modo sempre più evidente su tutto il cervello questo vale anche per l'attività enzimatica ricostituita nei cervelli
Questo stesso saggio di uno stato all'inizio in cui il sul fatti dello il substrato diretto dell'enzima viene ora metabolizzato al suo immediato coprodotto prato c'era Chiaramida in tutte le sezioni del cervello di un topo tratta
Per finire a molto rapidamente questi topi hanno qui dimostrato un'efficiente
Una validazione della della procedura di gin transfuga punto di sole l'attività biologica terapeutica istopatologiche
Abbia fatto ancora un ultimo tipo di sto di studio in cui topi erano stati trattati prima ancora delle tali insorgenza manifesto dei sintomi entra in torno ai sei mesi Cugno quello bilaterale poi sa già chi dopo otto mesi quindi quando sono ormai i loro quando normalmente i topi hanno sviluppato la malattia assaggiati per la il comportamento e la capacità di apprendimento queste lesioni cerebrali che vi ho illustrato portano a deficit comportamentali che si estrinsecano in nella incapacità dell'animale di apprendeva delle funzioni complesse come in questo caso saggiato e da un teste
Delle radio al mese in cui un topo viene viene introdotto all'interno di un labirinto allattare né dei cui bracci di sabbie del cibo
Il topo è libero di muoversi e di rivisitare queste braccia e di attualmente cibarsi e potrà farlo in successione variabile al poiché ogni volta che il topo mangia non vi è non viene resterà sostituito il cibo
A un certo punto il topo visiterà un braccio già visitato e quindi non mangia più
Questo lavoro viene considerato un errore e il testo misura
Dopo quante Dip quante prove il poco fa un errore è chiaro che un topo che non conosce la grinta fa un errore dopo quattro cinque o sei di queste prove non i giorni il topo fa la stessa prova
E quindi progressivamente un topo qualità e Pin Tara o sviluppo diciamo una strategia per cui mangia senza mai sbagliare tutte rotto i bocconi questa è la mia ultima positiva in cui vedette il comportamento di un topo
In rosso qual type che a nei giorni successivi delle prove impara e quindi riduce la sua frequenza di errori fino a mangiare in sequenza perfetta il cibo
Il topo invece knock-out privo dell'enzima risultata asiatico in sviluppo la patologia più diciamo illustrato prima non riesce a imparare e quindi nonostante il trend in continua a sbagliare dopo un certo numero di prove questo topo è stato anche trattata con un vettore di controllo e naturalmente non ha cambiato questo gruppo di topi non ha cambiato il suo comportamento vedete invece che i topi in bianco trattati con il vettore terapeutico
Si sono comportati come qualità e questo dimostra che l'intervento di Tito in transfer è stato in realtà terapeutico e ha permesso di prevenire in cui a secondo usato in modo completo allo sviluppo dei sintomi neurologici comportamentali
Non soltanto è un altro la strategia illustrate sopra ben tollerata permesso gestazione sostenuta dell'enzima e un'ampia diffusione della FITA terapeutica ma anche la correzione dirà neuropatologia la protezione da i danni neurologici
E quindi questi possiamo quindi pensare che questo approccio che sia pure invasivo ha ben tollerato ha però un potenziale terapeutico indubbiamente importante che va che merita naturalmente la successiva prosecuzione voglio solo riconosce il contributo del del delle persone che hanno fatto questo studio in particolare nel mio laboratorio Torino Antonio folle infine Lori Hayes che hanno lavorato e Silvia Bacco vice alla allo sviluppo dei nuovi vettore più infettive ho già parlato di Antonella Consiglio nella foto di Claudio Bordignon soprattutto che ha fatto Gioppato del lavoro
Sul sui topi e mail di insieme Angelo quattrini che il nero patologo del San Raffaele salvata Martino che ha sviluppato i saggi mutamenti massicci
E i saggi comportamentale stati fatti nel laboratorio di Vincenzo c'è stare del centro di Psicologia del CNR a Roma vi ringrazio per la
Grazie dice perché l'aver condiviso con tanta chiarezza tutti i dati che non sono ancora pubblicati purtroppo e non certo per colpa tua abbiamo accumulato ormai un ritardo complessivo grave il coffee break che comincerà tra un secondo
Durerà quindi fino alle undici e quaranta undici e quarantacinque quando vi sarà un saluto
Dei sottosegretari per l'industria per la sanità rispettivamente dottor pastiglie dottor Labate e quindi ci sarà poco più di un quarto d'ora venti minuti di coffee break
Io
Non vorrei tagliare se c'è qualche domanda ho una domanda importante però lo limiterei a quella dopodiché interrompiamo per il coffee break perché la mattinata è già stata lunga e sicuramente tutti ha bisogno di un attimo di riposo se c'è una domanda
Ok
Lo ripeto io ripeto e lo ripete il ginocchio profana
Senza PPT perfetto critica primo punto b
Qual è la Putin aprirà alle che dica queste sequenze che può in questo modo il responsabile degli affetti qua e solo da pochi inviati ben a entrambe le domande che sono importanti non risposta alla
è presumibile che la sequenza debba essere al centro del genoma come lo è nel vivo se lo vende il rettore che non abbiamo saggiato
E anche altri che stavano su cui stava lavorando ma non l'abbiamo fatto degli studi sistematici come funzioni non è chiaro potrebbe creare un sito di legame la patina che verosimilmente salgono fino al cellulare che media il trasporto o potrebbe anche semplicemente internet amiamo struttura conformazionale della doppia catena di DNA introducendo discontinuità e permettendo non rilassamento
Però non abbiamo dati
Io mi fermerei Quality sei d'accordo grazie a te a tutti gli altri spiccherà gli organizzatori ma soprattutto all'odierno sarà voi ci siete rimasti
Per programmare sta invariate inizia il ruolo cioè di terapia genica che è coordinato
Conto
E scusate questa modifica al calendario dei lavori congressuali
Ma ci sembrava opportuno su richiesta dei rappresentanti del governo qui presenti non onorevole Maria Grazia Labate sottosegretario alla Sanità e l'onorevole Passigli sottosegretario all'industria poter creare un'occasione
Per mettere agli esponenti del governo di portare di di portare un saluto ai congressisti io quindi lascio subito la parola all'onorevole Passigli sottosegretario all'industria grazie
Grazie un ringraziamento dagli organizzatori una grazia mento a tutti voi per essere presenti
E una scusa per avere interrotto brevemente come vedrete i lavori dei vari Pamiers per portare un saluto d'altra parte è doveroso specie alla luce
Dei dubbi circa interesse che il governo poteva e ha per una manifestazione di questo tipo quindi un saluto del Governo di un Governo che vuole
Incrementare la ricerca e i fondi da destinare alla ricerca in questo Paese e che vuole operare per facilitare il trasferimento dei risultati della ricerca al sistema produttivo poi il vero problema che abbiamo dinnanzi uno dei problemi più difficili da risolvere comune a molti Paesi e lo stato della ricerca in Italia come voi sapete molto deficitario noi spendiamo tra denaro pubblico e denaro privato in ricerca circa l'un per cento del PIL
Il Giappone ne spende tre volte tanto i nostri competitori europei Germania
Inghilterra spendono il doppio di quello che noi spendiamo il numero di ricercatori attivi in questi paesi segue più o meno queste proporzioni tre volte di più non come numero assoluto come percentuale ovviamente
E nei paesi tipo il Giappone gli Stati Uniti il doppio in altri paesi europei quindi questo è uno dei grandi problemi del Paese
Problema che il nostro Paese è che non non è quello che si fa ricerca pericolosa è che non si fa sufficiente ricerca
E non fare sufficiente ricerca significa in futuro non essere competitivi la competizione non è più una competizione sul prezzo dei prodotti e sulla qualità sulla natura dei prodotti
Innovazione tecnologica
La la ricerca scientifica che ne sta alla base e l'innovazione tecnologica sono quello che assicurano il benessere di un paese negli anni futuri
Quindi è il vero problema è non fare restare indietro un Paese che ormai nel novero dei grandi Paesi industrializzati
Che siede a pieno titolo nel nel G7 ora G otto qui futuro forse G dieci ma comunque che stanno e le grandi potenze
Industriale ma che deve starci sempre più con prodotti che siano all'avanguardia
Se noi guardiamo la nostra bilancia dei pagamenti bilancia tecnologica dei pagamenti vediamo che stiamo perdendo terreno quindi uno dei compiti degli ultimi governi che gli ultimi governi questo non fa eccezione si situa in una linea di continuità con il precedente
Uno dei compiti che i governi si sono assunti è quello di invertire questo stato di cose di rilanciare la ricerca
Cosa occorre fare
Quindi in concreto per prima cosa confermo che esiste una volontà politica in questo senso proprio ieri il ministro dell'industria all'assemblea di Confindustria confermava
Un forte interesse del Governo per il settore che qui viene trattato cioè per le biotecnologie dicendo che si farà pieno uso del fondo per l'innovazione tecnologica che esiste presso il ministero dell'industria
La legge quarantasei che a condominio tra il MOSE il ministero dell'Università e ricerca scientifica il ministero dell'industria
Verrà utilizzata sempre più diciamo congiuntamente in maniera da massimizzare negli affetti faremo dei bandi tematici per specificare
Tecnologiche o territori di strette di tenuti strategici
E letta diceva in particolare che l'obiettivo della politica industriale del governo è quello di una politica della ricerca industriale per i settori science based quindi la ricerca scientifica è la base della politica industriale di questo governo
E aggiungeva lo cito proprio testualmente penso in particolare alla ricerca farmaceutica e biotecnologica nella quale alcuni paesi europei hanno mangiato politiche di sviluppo che hanno avuto grandi affetti
Gli stessi grandi affetti desidereremmo vedere invece vederli da noi in Italia quindi c'è una volontà politica in che cosa si tradurrà si dovrebbe tradurre mi auguro appunto che sia possibile
Nell'ambito delle compatibilità generali in una finanziaria che abbia più risorse
La legge finanziaria da adottare nell'autunno che abbia più risorse per la ricerca pubblica privata in un incremento nel numero dei ricercatori che significa sempre ovviamente maggiori risorse e nella messa a punto di strumenti specifici tipo un fondo
Da gestire con denaro pubblico ma anche condannato del vento ha capito con istituzioni come Sviluppo Italia che sarà presente qui col suo presidente del pomeriggio
Che derivano insieme a investitori privati investire nelle aree ad alto rischio come si provocano interventi di denaro privato in area alto rischio di investitori privati
Investono sin are alto rischio ma quando vi sono delle speranze reali che questo alto rischio possa portare poi all'equivalente dell'alto rischio tre alti profitti allora noi siamo invece interessati a farsi che questo denaro affluiscano in una fase iniziale
Del passaggio dalla ricerca scientifica all'applicazione industriale dobbiamo trovare il così detto sì domani il il il il denaro necessario a seminare a far sì che dalla ricerca si possa passare al prodotto
Al al processo produttivo industriale quindi al prodotto finito un fondo partecipata dallo Stato insieme alle grandi banche di investimento
Che destini Investimenti alle sette ai settori ad alto rischio per facilitare gli spinoff accademici per per facilitare quelle che ormai si conviene che anzi conviene chiamare start-up cioè nuove imprese industriali nel settore potrebbe essere sull'esempio di quanto è stato fatto ad esempio l'Inghilterra
Una risposta perché funzioni il denaro pubblico deve essere sufficiente capiente e deve essere un denaro disposto a ritirarsi cioè a permettere che poi una volta che l'impresa è decollata
Sì posta da parte degli investitori privati comprare
Al costo avere un col quello che si chiama tecnicamente un conto è il diritto di comprare la quota pubblica al costo iniziale per incentivare l'afflusso di denaro privato nel settore ad alto rischio
In questo le fondazioni bancarie possono avere un grande ruolo non abbiamo un governatore della Banca d'Italia molto sensibile ai problemi della ricerca in Italia
E quindi un po'governatore che non si opporrà a a che le fondazioni bancarie
Invece di finanziare o invece di finanziare solo singoli progetti di ricerca in questa o in quella universitaria partecipino al capitale di rischio di impresa
Che fanno ricerca di nuove impresa in settore di alta tecnologia se questo avverrà avremo un amplissima risorsa a disposizione perché le fondazioni bancarie genera ogni anno qui parliamo non dei loro capitali ma dei proventi annuali che possono destinare al sostegno delle varie attività cui la legge chiama le fondazioni bancarie
Una di queste attività e il sostegno alla ricerca invece di sostenere singoli progetti di ricerca si pensa di far sì che le fondazioni bancarie possano oltre a sostenere singole progetti di ricerca anche partecipare al capitale di rischio di nuove imprese
Naturalmente nell'ottica appunto e poi di renderlo disponibile agli imprenditori che lavorano in quell'impresa perché la funzione è proprio quella di stimolare l'avvio e che la cosa più difficile
Quando un prodotto comincia a essere i risultati e la ricerca cominciano a essere appetibili è facilissimo trovare denaro come sanno tutti Venture capitalist è difficile trovarlo in questa fase iniziale
Esiste un clima favorevole per tutto questo voi potreste credo
Alla luce di quanto è avvenuto in questi giorni
Al limite anche dubitarne io credo che invece il clima sia favorevole
è favorevole sicuramente per tutto quello che riguarda le tecnologie dell'informazione della comunicazione c'è però nel mondo un clima favorevole alle biotecnologie sulla base di quanto le diuturno logiche contribuiscono al benessere dell'umanità in tutti i sensi benessere ovviamente fisico dal punto di vista della salute
Ma anche dal punto di vista del sviluppo economico del benessere complessivo di una società l'Italia fa eccezione gli eventi di questi giorni sono sintomatici di una atteggiamento della pubblica opinione
Io credo che sia una questione di comunicazione e di informazione e a volte ci sono delle astuzie nella storia io spero che gli avvenimenti le luci riflettori che si sono accesi su Genova
Alla fine portino a una maggiore attenzione per le biotecnologie per quanto di buono le biotecnologi si portano dietro devo solo dire che non esistono Biotecnologia buone nel camposanto della sanità bio tecnologie che sono in un limbo campo dell'ambiente e biotecnologie cattive quelle dell'agroalimentare
Le biotecnologie sono qualche cosa di unico che si può applicare in tutti i settori
Occorre fare ricerca secondo parametri certi e sicure la sperimentazione è parte fondamentale della ricerca in tutti il mondo senza sperimentazione nelle scienze sperimentali non si fa ricerca
La sperimentazione quindi è necessario in ognuno di questi campi naturalmente va fatta secondo protocolli diversi
E quindi con un piena aderenza al principio di cautela anzi direi che la sperimentazione aumenta le sicurezze
Che possiamo dove andare che dobbiamo domandare dai prodotti che poi vengono immessi sul mercato la sperimentazione quindi non va vista solo come un momento per la creazione di nuovi prodotti
E anche un momento di verifica di processi esistenti di prodotti esistenti e senza di essa non abbiamo quelle certezze quelle sicurezze anche nell'agroalimentare che dobbiamo domandare naturalmente bisogna che la sperimentazione avvenga in maniera controllata non c'è dubbio che l'Italia è uno dei Paesi più attenti anche in sede comunitaria e più diciamo rigidi unendo mandare nel domandare processi di verifica adeguati la principale sosta uno dei principali Paesi sostenitori del principio di cautela
è proprio l'Italia naturalmente bisogna creare condizioni alla sperimentazione perché questa possa avvenire se noi creiamo condizioni così rigide che la sperimentazione non avviene in pratica fermiamo la ricerca credo però che al di là di questo momento
Poco a poco e mi auguro rapidamente anche nel campo agroalimentare il processo di ricerca di sperimentazione possa riprendere e che l'Italia non faccia eccezione rispetto a tutti i paesi dove si fa ricerca molti paesi
Fanno ricerche in maniera meno sicura di quello che noi vogliamo sicuramente l'Italia sarà uno dei paesi in cui la ricerca e la sperimentazione avverranno secondo protocolli di assoluta garanzia
Quindi io spero che alla fine il tormentato avvio di questa di questa manifestazione così importante si traduca per una di quelle astuzie della storia che dicevo prima in maggiore attenzione e maggiore importanza de Baggio l'attenzione per le biotecnologie
E maggiore importanza di questo settore nell'ambito dell'azione di governo
La ringrazio innanzitutto per l'invito sono qui in rappresentanza del ministero della Sanità
Nella mia città dove che vi ho appunto rappresenta questo momento di incontro della scienza del mondo dell'industria del mondo della ricerca per soffermare la propria attenzione sua al che punto siamo sulle biotecnologie
Ma sono anche qui e ho visitato la tenda dei movimenti ambientalisti prima di entrare qui
Perché io credo che eventi così importanti sul terreno scientifico
E diventano sempre più importanti in quanto capaci di creare dialogo comunicazione sensibilità ascolto e attenzione anche alle diverse culture che hanno animano la presenza di movimenti associativi nel nostro Paese
Del resto mi abbiamo un esempio d'Oltralpe dove i movimenti associativi sono molto più forti e più contrattualistiche da noi
Quindi la mia presenza qui e non solo diciamo di ringraziamento per un evento altamente qualificante sul piano scientifico
Ma è anche una presenza che vuole dire proprio da qui partiamo per creare quei canali di scorrimento dentro fuori che altrimenti potrebbe in una fase di transizione politico culturale del nostro Paese
Farci prendere da una sorta di irrazionalità rispetto al progresso scientifico
Ai fattori importanti che la ricerca oggi mette a disposizione dell'umanità
E dall'altro potrebbe farci rinchiudere in una visione tardo romantica utopistica tutto ciò che è nuovo e cattivo e tutto ciò che è nuovo e non è controllabile al cento per cento e da rifiutarsi
Come si può creare questo canale di comunicazione importante perché riparlo molto di più al mondo della scienza avendo diciamo dalla mia una formazione professionale in questo campo
Se non immaginando che la scienza come riconosciuto a livello universale pone tra i suoi fondamenti etici il principio del limite che tutti quanti assumiamo
E come non immaginando che la scienza di fronte a grandi problemi che oggi diciamo sono quasi devastanti per l'umanità in questo caso mi pongo più sul terreno delle politiche per la salute di fronte come dire a un insorgere di patologie sempre più rilevanti sempre e più crescenti in cui nei siti Inter concausalità sono molto pregnanti per cui ci chiamano ad un compito molto attento nel momento della ricerca applicata e in quella di base come può la scienza non immaginare che esistano degli organismi regolatori
I democrazia partecipata
Le quali appunto l'osservazione l'attenzione siano diciamo i canali attraverso i quali il prodotto dell'ingegno il prodotto della ricerca applicata si pongano diciamo le finalità che al di là di ogni concezione utopistica io credo debbano essere sempre indirizzate a ricercare un'importante equilibrio
Tra innovazione scoperta scientifica tecnologia un uomo ambiente ecosistema nel quale etica e quindi siccome da tempo leggiamo anche lo sforzo che in ambito europeo
Viene fatta intorno al tema degli organismi regolatori non uso il termine controllore degli organismi regolatori che osservano come la produzione scientifica si cala non solo sull'essere umano ma sull'ecosistema riprendo l'ultimo passaggio di Passigli loro sanno che le regole europea internazionali di questo governo ci stiamo preparando al Millennium Round
Sono quelle che afferma non è il Codice di partecipazione dell'Italia il principio di precauzionali sta e in principio della reciprocità dal punto di vista della messa insieme di interessi che non per definizione debbono essere confliggenti
Quindi salute umana ambiente sviluppo economico sviluppo della ricerca scientifica
E in questo senso il nostro ministero della Sanità voglio dirlo ai presenti ma l'ho detto anche ai movimenti associativi che sotto la tenda di mobili tempio si radunano
Il nostro ministero della sanità ha rispetto ai nostri Paesi europei io il partner d'oltre Europa
Caratteristiche molto importanti sul terreno della tutela e promozione della salute umana
E organismi molto importanti dal punto di vista del controllo dell'applicabilità del prodotto della scienza io vedo di fronte a me
Il dottor Moscardi che il direttore dell'ISPES uno dei più importanti organismi i cui il Ministero della Sanità si avvale sul terreno della prevenzione della sicurezza
E mi rendo conto che forse Passigli noi siamo un po'deficitari come governo negli strumenti di comunicazione e di informazione verso i cittadini
Perché per esempio mi è noto che dispensa proprio tre progetti in campo
Che sono quelli relativi alla tenuta sotto controllo
Degli effetti dei prodotti biotecnologici sulla salute umana per quello che riguarda la nostra competenza mettendo veri e propri protocolli di comportamento nell'osservazione dei fenomeni e nella indicazione di linee guida di comportamento questo per dire che mi sento sufficientemente tranquilla dal punto di vista dei nostri compiti e delle nostre competenze
Perché il prodotto della scienza biotecnologica della ricerca biotecnologica per quanto riguarda l'impatto sulla salute umana trova il ministero della Sanità
Tutti gli organismi deputati atti questo controllo spiega nel principio del limite nel principio della precauzionali sta né il principio della tutela e della sicurezza della salute degli individui ne abbiamo discusso proprio a banchieri sera al Ministero della Sanità
Con il ministro Veronesi e avvalendoci noi di uno strumento molto importante come l'Istituto superiore di sanità
Che il nostro organismo tecnico scientifico che fa osservazione epidemiologica per le competenze delle politiche della salute
E abbiamo immaginato che oltre a questo nostro organismo occorreva in questa fase non per i fatti che sono accaduti a Genova e che al di là della grande riuscita di questo convegno della grande partecipazione
Di movimenti che hanno diciamo imposto all'attenzione pubblica il problema della sicurezza del cittadino quando vive in un determinato ambiente produce e consuma e abbiamo pensato che era nostro dovere proprio per i compiti istitutivi del nostro ministero di istituire un osservatorio presso l'Istituto superiore di sanità
I cui componenti vedessero le rappresentanze non solo dell'Istituto superiore di sanità e dei dipartimenti alimentazione prevenzione del ministero ma anche di ricercatori scientifici anche di rappresentanti delle associazioni
Per costituire una prima sperimentazione nel nostro Paese
Gli strumenti di osservazione e di regolazione dei fenomeni che abbiano dentro quella regola della democrazia partecipata unico strumento io credo che possa dare a tutti noi
Nel riconoscimento della validità scientifica delle nostre ricerche delle sperimentazioni che avvengano la sicurezza di moduli applicativi sul terreno del controllo e della regolazione
Questa è una decisione che noi abbiamo assunto con molta forza perché riteniamo che per nostro compito d'istituto promozione e tutela della salute umana avessimo il dovere di tentare una strada anche innovativa nel contesto europeo in cui non è più possibile che il mondo della scienza e società
Non dialoghino non comunichino non siano reciprocamente informati tali appunto da proporre alla Società del terzo millennio
Quello che ho chiamato una specie di bagaglio culturale molto improntato sulla paura dell'innovazione
Quindi con forte cariche di razionalità e dall'altro con una invece bagaglio
Che tende ad un ritorno al passato o un elemento naturalistico come salvifico
Di tutte le tragedie umane che questo secolo che si chiude ha posto all'attenzione del pensiero scientifico e culturale quanto meno occidentale e con questo è stato il nostro impegno vogliamo tentare questa strada
Infine un ultima considerazione sugli impegni di governo sul terreno più propriamente della ricerca proprio ieri Passigli sa siamo stati tutti impegnati quindi ci dispiace di non aver potuto essere presenti prima in questo consesso
E proprio nella riunione del CIPE che è avvenuta alle ore quindici e che ha varato Jonio portato una copia qua forse sarà utile per tutti i ricercatori e gli istituti presenti apprendere quali sono le linee
Che il governo si propone di affrontare abbiamo varato il piano sax nazionale della ricerca in cui accanto a dei limiti indirizzo strategico ci sono i finanziamenti che questo governo intende mettere in campo
E devo dire con un profonda nella discussione tra i ministeri competenti ricerca scientifica Tesoro industria sanità e ambiente abbiamo assunto una grandissima responsabilità
Molto grande che naturalmente lo ricordava appassiti
Deve stare dentro il rispetto dei patti di stabilità dei parametri di Maastricht e in quelli del nostro Paese per il recupero del debito pubblico ma che ci vede grazie alla riforma
Del sistema di ricerca scientifica uso questo termine osare la strada del rilancio
Il nostro piano contiene un incremento del rapporto di risorse finanziarie sul PIL come diceva Passigli
Vede questo gap enorme dell'Italia rispetto all'Europa del resto del mondo che dall'uno e tre deve passare in due trienni al due per cento
E in questo piano abbiamo saputo indicare sugli obiettivi strategici prioritari in che modo risorse pubbliche e private
Concorrono a raggiungere gli obiettivi e questo badate un tema molto importante nel nostro Paese io diciamo seguita solo dei quotidiani
L'andamento dello sviluppo del dibattito dei diversi simposio
Ebbene è una cosa che bisogna dire con molta forza
Se no non c'è consapevolezza e che purtroppo nel nostro Paese il sistema della ricerca ha proceduto
Per molti anni come dire in una specie di canali chiuso non ha mai colloquiato col mondo dell'impresa col mondo dell'industria
E si è creato questo gap di Bari Cantet che oggi ci pone forti problemi in termini di competitività europea e internazionale anche grazie ad una visione molto rigida estatica
Degli strumenti esistenti in ambito universitario le grandi enti di ricerca in ambito industriale per cui da un lato si è fermata in Italia all'idea
Non sempre basata su elementi razionali e concreti che nel nostro Paese avesse prevalso una cultura più da ricerca pura di base che non aveva nessuna intenzione di confrontarsi con il terreno della ricerca e lo sviluppo
E dall'altro di un'industria tutta protesa a fare profitti e investire molto poco in ricerca per molti anni è stato vero è stato così
Noi osserviamo invece nell'ultimo triennio un dinamismo molto forte
Molto importante che la riforma del sistema di ricerca nel nostro Paese ha saputo compiere e allora ieri votazione su un piano di ricerca anche non solo duplica e raddoppia nell'arco del triennio le risorse per portarle a quel livello almeno in tre
Anni di progetti di medio termine in sei i lungo termine ma in cui ci sono tutti gli strumenti innovativi con cui la società italiana
Mette in campo saperi conoscenze e competenze
Il traslata di università e dei centri di ricerca dentro le industrie riassume dalla ditta alle industrie nel sistema di ricerca proprio per creare quel felice fibre
Che può farci davvero competitivi in Europa e nel mondo anche qui con regole con regole io non oso pensare abbiamo dato tanti dati non oso pensare perché vedo tanti giovani per questo lo dico
Deficitario rapporto ricercatori popolazione nel nostro Paese pazzesco
E non oso pensare invece a quale impulso per l'occupazione ricerca di base ed applicata l'Italia potrebbe dire grazie alle grandi potenzialità le risorse del proprio ingegno se per esempio sapessimo sfruttare
Tutti i principi nuovi della brevettabilità non solo della ricerca di base ma di quell'applicata ecco qui
Noi abbiamo assunto delle responsabilità molto grandi molto grandi in epoca in cui l'inflazione non è solo quella che avevamo preventivato
E in epoca in cui ancora il peso della spesa pubblica incide sui bilanci dello Stato abbiamo saputo con questo piano raccogliere una sfida una sfida molto importante
Noi ci auguriamo che da iniziative come queste di approfondimento su un terreno delicato della ricerca scientifica
Come nella biotecnologia il prodotto della sua applicazione ma come in altri campi molto importanti Ministero della Sanità in accordo con il ministro Zecchino per esempio ha proposto sei settori di intervento
Malattie metaboliche
Cardiovascolari
Baccini e fattori immunologici su cui sappiamo per esempio le biotecnologia e non solo a livello di ricerca ma già di produzione di farmaci biotecnologici stanno dando diciamo buoni e validi risultati
Perché per esempio il male che ancora affligge la nostra popolazione come prima causa di morte processi di cancerogenesi e tumori
Troppi non sul terreno del farmaco biotecnologico una terapia adatta rispetto a ciò che oggi usiamo e conosciamo
Che certo ci aiuta Emma per fattori di posso i tossicologia molto rilevanti mettono in difficoltà l'equilibrio biologico del nostro sistema immunitario e come qui facciamo
Delle scelte importanti raccogliamo anche delle grandi sfide
Portiamoli avanti con coraggio misurandoci anche se abbiamo culture e sensibilità differenti il governo deve essere sul campo deve accettare la sfida del confronto deve sapersi misurare con la ricerca con i movimenti associativi con le culture e le sensibilità diverse ecco forte
Di aver compiuto una scelta e questo piano la compie immaginate cosa è stato ieri strappare
Al ministro del tesoro il raddoppio delle risorse in ricerca
Per il primo triennio non è stata una battaglia facile ti garantisco anche se il governo ha una maggioranza compatta sul terreno dei propri indirizzi ma come si sa bisogna fare i conti con la realtà queste una realtà sfidante
Raccogliamo le insieme e diamo i cittadini anche la sicurezza che si avanza un canale di colloquio ed informazione reciproca
Italia porterà portare in Europa il suo contributo disfida all'altezza del tempo ma anche di strumenti regolatorie partecipativi in cui il frutto della ricerca sia davvero in funzione per il bene dell'umanità che credo sia il sentimento con cui tutti voi lavorate nei diversi laboratori scientifici e anche nel mondo industriale di ringrazio
Su questo tema la ricerca scientifica dopo
Saluto interessanti parole degli sottosegretario all'industria alla sanità penso che sarebbe opportuno che anche al professor Leonardo Santi aggiungesse qualcosa
Ma io volevo cogliere l'occasione di due autorevoli rappresentanti del governo
Per una considerazione su quello che è avvenuto nella nostra città in questi giorni in un convegno importante che ha visto la presenza i ricercatori di tutto il mondo di elevata qualità
I giovani così numerosi interessati che si sono anche pagati la loro iscrizione che dimostra l'interesse e l'impegno per un campo che suscita interesse gli altri giovani forse all'esterno lo dimostrano che non può essere più trascurato
Dal forze politiche dal governo e dal Parlamento
Molto spesso succede che alcuni elementi di incomprensione nascono perché non c'è un piano politico un piano strategico su ciò che interessa il nostro Paese
Nora andare a discutere di problemi certe volte che sono nella fantascienza e che sono propri di altri paesi come il pesce artico che non ci riguarda affatto
Allora il problema per noi è quello di fare una strategia nel nostro Paese identificando
Ciò che interagisce
Per la nostra nazione per la nostra collettività anche poi con lo sguardo a interessi di altre nazioni questo non c'è dubbio ma tenendo presente un fatto essenziale il prodotto della vostra ricerca dei giovani
Se non c'è un tessuto industriale italiano che popoli cedere il prodotto di una ricerca appagate finanziata dal da strutture pubbliche
Viene poi necessariamente ceduto a industrie straniere che loro diventeranno nel nostro mercato questo deve essere capito il confronto ci deve essere parlo adesso anche come Comitato nazionale della Presidenza del Consiglio
Noi abbiamo avviato un colloquio un confronto con tutti con l'industria insieme anche al senatore Passigli
Con i ricercatori con i movimenti di opinione
Sono tutti d'accordo su un confronto serrato non su forme di cogestione
Ma su forme di confronto reale che possa portare a delle scelte autonome delle forze politiche che sono quelli garantiva verso l'opinione pubblica e verso la collettività
Allora noi dobbiamo fare un piano che abbia scelte di ricerca
Nei settori che sono di interesse nostro nella tutela della salute dell'ambiente ma anche delle interessi economici del nostro Paese per non penalizzare anche frange diciamo persone o settori come i piccoli agricoltori allora noi abbiamo una nostra particolarità che noi trasferiamo anche in Europa perché l'Europa si confronta con gli Stati Uniti
Spesso anche in aspetti conflittuali ma che devono arrivare poi al superamento di una situazione differenziata nel mondo che trovi una politica generalizzata che sia a vantaggio di tutte le popolazioni allora
Fra la invito che viene da questo convegno non da me
Ma dal convegno e da tutto ciò che è accaduto Genova in questi giorni
E che è un una situazione come questa un progetto come questo cioè il sulle biotecnologie non può essere ulteriormente ritardato da chi ha la responsabilità di Governo e del Parlamento
Allora c'è
Rizzo il più del più furbo anche cioè hanno anche a Mosca proprio viaggio
Se
Capacità ma siamo noi dobbiamo scappare kamikaze
L'idea
Vorrei informare che i convegni scientifici ora proseguono secondo il programma e ringraziamo molto per l'intervento dei sottosegretario del professor Santi che sono stati illuminanti e sul nostro futuro prego
Corposo Crescenzo
Regime ora
Presso
Solo elettorato settoriale offre che era il momento il peso che la sola regione trovare alcune
Bravissimi potrà qualcosa
E protagonista dalla collega
Ad esempio grazie all'onorevole avevano
Vediamo gli altri sedazione
Sei sette
Sarebbe
Ma
In questa sala prosegue adesso la parte che si occupa di terapia genica con un workshop
E vorrei informare che il professor giacca ci parlerà dello stato dell'arte
Della Claudia contiene ama illustrandoci anche quello che riguarda la problematiche legate a questa nuova scienza e vorrei anche dire che stanno a tre interventi di Biotechnology di cui due giovanissimi borsisti e quindi vi pregherei anche perché lo abbiano la possibilità di presentare i dati di laboratorio di restare fino alla fine abbiamo un certo ritardo però in un'ora dovremmo riuscire a finire la sessione ma ora Giac
Già e aveva anche
Io sono al minimo
Sì sempre accese
Abbiamo sbagliato diapositive proprio mia questa lei non è una diapositiva fatta
Questo riguarda ricamare preoccupata
La depositi l'hanno fatta Genova fatta fuori del mio studio fuori dalla dalla Scuola Normale proprio sotto la finestra del mio studio
Un paio di settimane fa mi piace farla vedere ovviamente perché molto di attualità in questi giorni e perché io sono fra la mente convinto & è una convenzione che penso tutti noi
Condividiamo ampiamente che il mondo delle biotecnologie abbia avuto un grandissimo difetto nei confronti dell'opinione pubblica
Che in qualche maniera adesso così si realizza in questo difetto delle Piepoli che avrebbe al nei confronti del mondo e Biotecnologia ed è un difetto prevalentemente di comunicazione e di informazione c'è in realtà la discussione se Beethoven oggi è una discussione che non è informata in cui entrambe le parti non condivide lo stesso livello di informazione
E sa dire questo perché quello che vuole fare oggi è così fare una chiacchierata di terapia genica che in realtà mostrarvi come questo grosso difetto di comunicazione era lady informazione c'è stato un difetto che ha permeato anche il mondo della terapia genica dall'inizio ad oggi cioè negli ultimi dieci anni andrebbe lo voglio ridire così in maniera più elegante prendendo a prestito una frase prendi un editoriale di las dell'anno scorso e problema chiave la terapia genica dopo undici anni di sperimentazione più di quattro mila pazienti trattati e più di quattrocento tre al clinici in cui i pazienti hanno avuto invii voi ex vivo
Del materiale ingegneri Zanato è un problema di giustificazione della pochezza di risultati
Finora ottenuti molto e troppo è stato promesso degli anni iniziale della terapia genica molta enfasi è stata messa su quali sono il potenziale applicativi la facilità con cui il terapia genica risolverà i grandi problemi
Della salute dell'umanità
Molto è stato anche speso dai giornali dai mezzi d'informazione nell'enfatizzare la facilità con cui questo avviene in realtà molto poco è stato realizzato questo è stato più che altro che nel più che un problema così effettivo del di questa disciplina un problema di scarsa informazione in cui naturalmente gran colpa ce la la così l'educazione
Generale della popolazione gran parte c'erano i giornalisti ma gran parte di colpa ce l'ha anche chi fa terapia genica era speso troppo facilmente risultati in realtà non aveva in tasca possiede positive
E quello che ha scusi cosa fare
E quello che vorrei fare io oggi così commentare quindi quali sono stati i problemi di questi dieci anni di terapia genica così cercare di quindi fargli condividere la convinzione che in realtà questi dieci anni lo sono i dieci anni in cui la terapia genica non ha funzionato ma sono stati dieci anni in cui la terapia genica ha cominciato a capire quali sono i problemi veramente rilevanti la cui risoluzione è assolutamente necessarie prima che la terapia genica
Funzioni quindi farvi condivide la convenzione che in realtà noi oggi sappiamo molto molto di più
Di quello che
Potevamo sapere portavo neanche immaginare dieci anni fa in termini di complessità della situazione vi ricordo ci sono più di quattrocento sperimentazioni oggi in corso e che anche se il la terapia genica inanimata in ambiente di pediatrico per la terapia delle malattie mono geniche come eredità autosomica recessiva legate al cromosoma X in realtà queste applicazioni rappresentano soltanto meno del quindici per cento delle applicazioni totali
Di terapia genica mentre la stragrande maggioranza dei trials clinici sono per la terapia genica
Dei tumori tenero facendovi vedere come queste piccola categoria di altri tipi di applicazioni comprende delle applicazioni molto interessanti in ambito cardiovascolare che sono quelle in cui probabilmente la terapia genica avrà maggiore probabilità di successo nell'immediato
Subiamo alle sperimentazioni cliniche attualmente in corso temo che la maggior parte di questi tipi di sperimentazioni sono fatte utilizzando vettori virali di diverse classi diverse famiglie di virus
La nel preparare un vettore virale per la terapia genica eh qualcosa a livello clinico e anche a livello sperimentale e qualcosa di assolutamente non banale sia in termini di produzione biologica di sia in termini di validazione del vettore
Sia in termini di sperimentazione intimo animale soprattutto in termini di schemi in atto
Per la procedura per ottenere delle preparazioni che siano effettivamente e utilizzabili
Come quantità e come sicurezza a livello di pazienti però di fatto se uno vuol trasferire un gene con un'efficienza con la migliore efficienza che le attuali tecnologie consentono non c'è altra scelta che utilizzare un vettore virale
Sicuramente gli sviluppi che vengono
Compiuti in questi anni
Dello studio di molecole Catti Oniti lipidiche o di altri sistemi di trasferimento genico non basati su vettori virali pro metteranno molto in futuro soprattutto pro metteranno lo sviluppo di reagenti che siano semplici da utilizzare
E che posso essere semplicemente mescolate DNA iniettati in un paziente però la sullo stato dell'arte della situazione fa sì che in realtà l'efficienza di questi metodi
I due livelli pur per quanto semplici sia ancora assolutamente inadeguata si comparata all'utilizzo di vettori virali
I vettori virali che trasferiscono al meglio cellule in cultura sono e quelli che sono anche più conosciuti intermedi manipolabilità sono quelli di cui abbiamo sentito parlare estesamente questa mattina sono basati sui
Dettori basati sui retrovirus retrovirus
Hanno
Gratuito sono semplici perché hanno tre geni Gad Opole devono e possono essere completamente svuotato di questi tre geni tranne una piccola porzione di Gaber conti nel sito di pagine rimpiazzati con gene terapeutico
E prodotti a titoli alti ma non altissimi come abbiamo sentito da papa jeans line pertinenti
I vettori rétro virali hanno
Due tipi di grossissimi problemi di cui vi accenna il primo mi farò vedere il secondo
Il primo problema direttore dietro virali e quello che infetta non soltanto tra lo stupro soltanto cellule che si divide non solo i considerate
I nostro organismo la maggior parte delle ce lo stato d'animo sono ce le crescenti il cervello c'erano efficienti le cellule staminali ematopoietiche socievoli quiescenti il muscolo c'avete scientifica tono rigenerante ci riuscì cocenti novantanove per cento dei linfociti
Lo so sangue periferico sono Celli quiescenti queste immediatamente
Toglie tutto questo tipo di applicazioni a la trasduzione con i vettori
Retrovirale le sento parlare da Luigi Naldini la possibilità di superare questo limite con i vettori basati su APV voglio spendere Santo due parole perché poi non ci ritorno più sui vettori adenoma sui vettori a demolire Ali e il grande problema dei vettori virali virali che trasferiscono in maniera straordinariamente efficiente assolutamente migliore di così se accettasse di vettori cellule in virtualmente una grandissima varietà di cellule sia in cultura fin vivo ma il loro grande problema e quello che ha tuttora i vettori a demolire Ali nonostante delezione progressive del antigeni contenuti ed espressive questi vettori
In realtà continuano a possedere in
Informazioni
Che dirigono la la la che stimolano una grossa componente immunitaria reagire contro Lecce in infettate questo è vero
Per e i vettori di prima generazione che è un osso intuiti ingenua nei bambini col gene terapeutico è vero per il vettore di seconda generazione causa di tweet di tre dei quattro ed è vero anche per vettori di terza generazione che hanno altre delizie avendo il genoma
Se non sarà vero per Dettori quindi
Più recenti che hanno la rimozione di tutto il genoma
Questo è qualcosa che le prossime esponente azioni ci potranno dire ho letto stamattina di fretta prima del convegno che nell'ultimo numero che definì il numero scusate che lei nel nell'edizione di oggi il Corriere la sera ha riportato la notizia di un trial clinico bloccato in Pennsylvania per un altro paziente morto per l'utilizzo di questo tipo di vettori
Stati membri mostra
Recenti
Ad esempio se voi potreste chiedere utilizzando mettere retrovirale quale sia il destino tre espressione che introducete le spese del gene che introduce delle cellule a secondo del sito
Del genoma in cui questo vettore va a integrarsi questo esperimento
Un po'certosino fatto prendendo vettore retrovirale basato sul virus di Moroni e traducendo delle cellule
Mieloide laboratori poi clonando le singole cellule positive per la presenza del vettore quindi ciascuna di questi cloni che vedete qua elencati rappresenta un singolo evento di integrazione del vettore
Vedete che ci sono cloni in cui il vettore integrato ma non esprime assolutamente il gene che era posto all'interno e ci sono cloni in cui invece il vettore integrato ed esprimono in maniera ragionevolmente buona ci sono cloni in cui il vettore integrato
Ed esprimono in maniera molto molto elevata questo percentuali di correzione di un difetto genetico
Che è un effetto di un enzima si chiama
Superossido e sulla pena di piazza ossidasi ed è in difetto proprio di una malattia genetica molto rara che le malattie trovato sa cronica bene se guardate questo tipo di figura
Almeno io quando l'ho vista la prima volta mi sarei aspettato che in realtà questo rappresentasse il fatto che ciascuna di queste cellule aveva un'integrazione tale che il promotore
Era molto attivo queste ce l'ho con interazione tale che il promotore fosse poco attivo quindi esprimesse poco proteine queste cellule fossero eccellente il promotore invece era spento
Se voi viceversa andate a vedere queste cellule a livello di singola Cellule qui potete valutare blu e bianco e intensità del blu vi dall'intensità di quanto il ce ne si è espresso troverete una situazione diversa è abbastanza interessante e cioè questi sono cloni tutti i quali in ciascun pannello le cellule
Liceali ciascun pannello portano esattamente dello stesso provi russi integrato nella stessa localizzazioni genomica cioè in altre parole ciascuna delle cellule in questo pannello vecchio numero dieci
E assolutamente identica l'una all'altra e questo è vero per questo pannello questo pannello e tutti gli altri
Rete che la cosa curiosa
E che in realtà non esistono diversi gradi di espressione in termini di diversi numeri diverse livelli di blu delle cellule ma quello che voi vedete che quello che cambia da cloni che esprimono molto cloni che non esprimono quasi per niente
E il numero delle cellule positive
E cioè che pure essendo tutte queste cellule identiche l'una all'altra nella maggior parte di queste cellule successo un evento che ha inattivato l'espressione del provi russe
E la probabilità che questo evento accada evidentemente una probabilità che è diversa a seconda del sito di integrazione
Questo è un problema di silenziamento
Dell'espressione genica
Ed è un problema di silenziamento che avviene in qualche momento nella cellula che è stata è stata tolta se queste vento avviene molto precocemente la maggior parte delle progenie di queste cellule avrà il profilo si inattivo
Se questo evento avviene un po'più tardivamente avremo molte cellule con il profilo Us trascrizionale mente
Attivo e una piccola proporzione con il profilo se silenziato qui è un problema di livelli di espressione ma di percentuale di Charlot esprimono un po'motore può essere o attivo ho spento
E il problema che riguarda più prettamente la terapia genica è un problema relativo al fatto che questo tipo di evento di spegnimento genico è un tipo di evento che accade prima o dopo quasi sempre quando le cellule vengono tenuti in cultura contengono il gene a lungo tempo ad esempio queste sonde cellulosa del tradotte
Coltivate estensivamente miniera continua per diversi mesi
Analizzate per la presenza di provini russi in maniera quantitativamente delle cellule continuano a contenere il profilo s'realizzate per l'espressione di questo provi russe questa ha una certa percentuale all'inizio questa percentuale tende progressivamente a decadere
Questo stato un problema che moltissime sperimentazioni a livello clinico di terapia genica hanno incontrato cioè c'è una tendenza al progressivo spegnimento dell'espressione genica quando questa espressione genica
E in in questa espressione genica e sostenuta dopo trasduzione di vettori retrovirale
Il il superamento di questo tipo di eventi un superamento che richiede la comprensione dei meccanismi molecolari in cui questo avviene io non voglio assolutamente soffermarmi su questo ritiro soltanto che questo è un evento che correlato alla metilazione delle regioni dell'onta Minari Pitt del approvi Ross
E alla reclutamento da parte di questa Regione mitigate di enzimi che hanno la funzione di Stonehenge ACT dati sono enzimi che
Compattano la cromatina e spengono l'espressione genica in quella regione dirò anche che questo dov'è un tipo di evento che avviene soltanto per le trovi Ross ma è un evento che interessa un dominio genetico molto grande in cui il retrovirus fa a integrarsi potete considerare se
Se
Potete considerare come un
Il tipo di residuo
Evolutivo di difesa genomica
Contro l'inserzione di elementi esogeni con un residuo evolutivo con cui il silenziamento in qualche maniera spegne la possibile espressioni inappropriata di geni che si vengono integrate nel genoma
Cellule dei vertebrati
Queste considerazioni sui retrovirus insieme le considerazioni su Hui
Vettore della virali che facevo prima ovviamente spingono all'identificazione i nuovi e strategie per il trasferimento genico e quindi di nuovi vettori virali per il trasferimento genico
Anche qui ovviamente ci sono dei grossi problemi ma ci sono anche delle possibilità molto promettenti
Una ride le possibilità promettenti sono basate sulle utilizzo di un virus che parvo virus quindi un piccolo virus con il cui Genome DNA singolo filamento che il virus Aden associato che è un virus che ha che questo nome così molto sfortunato perché originariamente è stato identificato associato al culture infettate con l'adenovirus in realtà è un virus assolutamente autonomo e distinto da adenovirus e vi è un virus che ha la caratteristica la triste interessante di infettare una cellula e di poter andare incontro a un ciclo
Replica attivo in cui vengono prodotte moltissime particelle virali o a un ciclo latente in cui il DNA del virus e convertito ha una forma a doppio filamento e quindi trascrizionale mente
Trascorsa la mente attiva e viene integrato in una regione specifica del cromosoma diciannove c'è il virus con il virus va incontro questo tipo di integrazione che assolutamente specifica per quel tipo di Regione esiste pochissima conoscenza molecolare sulle proprietà
Di questo virus e lo sappiamo quali sono i meccanismi con cui converte il singolo filamento doppio filamento per replicarsi non sappiamo quali sono i requisiti cellulari perché va ad integrarsi in questa Regione consommé diciannove settembre apriamo pochissimo
Su quella specificità di sequenza di questo tipo di Regione
Ma nonostante queste in realtà essendo il virus molto semplice possiamo tentare di utilizzarlo come tipo di vettore virus codifica pena per due geni soltanto sono la proteina replica attiva rap la proteine codici dopo le proteine del capside capp
Si possono completamente rimuovere questi due opere ed in frame
E costruire dei vettori che hanno soltanto all'estremità del virus che è un'estremità me l'ha fatta vedere in questa prima diapositiva che forma
Questo
Struttura a rimaste menu look ripetuta al alle due estremità in maniera uguale del virus pesi posso lasciare queste due
Sequenze sole sequenze piccolissime centosessantacinque Paesi basi e si può rimpiazzare tutto il resto all'interno con il gene terapeutico che può essere espresso liberamente da quasi si promotore uno Possa avere interesse esprime lo sia costitutivo sia tessuto specifico
Quindi i vettori retrovirale i pittori medievali basati su Abu sua dei lettori che hanno il gene terapeutico e di virale hanno soltanto queste centosessantacinque paghi base cui ripetute all'estremità tre primo
Che sono le sequenze che vengono riconosciute per l'incapacità mento del virione questo tipo di costrutto viene e trasportato all'interno delle cellule insieme a un plasmide reciproco che codifica per Gabriele per permettere K ma non contiene le sequenza prendono mettere due estremità
E vengono indotte delle funzioni cellulari che servono per la sua replicazione
Soltanto questo tipo di costrutti olio sua il TAR non è in grado di replicarsi se la cellula non esprime delle funzioni che sono in grado di farlo replicare e tornano su questo fra un attimo da questi tipi di cellule che producono virioni virioni possono essere più o meno facilmente purificati e sono spettacolarmente la
Profili censore spettacolarmente capaci di infettare determinati tipi
Cellulari ad esempio se vengono iniettati all'interno della camera posteriore dell'occhio dopo un mese
Il il i la retina dei ratti iniettati contiene cellule positive per la presenza del virus questo virus
Con la green Flores in proteine e quindi qui queste le bifore stampato in colorata con l'anticorpo
Contro la proteina e queste sono le cellule i campionari della retina che sono i primi recettori nervosi sommi insomma del delle prime cellule recettoriali nervosa si trova a livello della retina in questo le cellule invece che contengono i foto pigmenti alla stessa maniera
Se il virus viene iniettato nel cervello di un animale studi russe in grado di infettare selettivamente una grandissima quantità di neuroni e cioè questo è un esperimento fatto insieme al gruppo di Lamberto Maffei
Nascono male a Pisa qui ben costruito un vettore Adone associato che esprimeva la propria linea
Bcl due e del virus è stato iniettato all'interno del nucleo genicolato laterale de Nicola pre test Rota psico ne ha fatto e dopo un mese questo il tipo di positività con vista con un anticorpo contro Bcl due lettere ci sono delle regioni
Dei nuclei Necci Mikati laterali di uno due tre ratti diversi in cui una grossissima percentuale di neuroni sono positivi per l'espressione della proteina
Se voi andate a vedere la quantità di neuroni positivi in questi tipi di regioni la positività est dell'ordine di ottanta novanta per cento dei neuroni lavorate nel contesto di tutto il ganglio genicolato laterale la positività è intorno al venti per cento dei neuroni che se essendo un esprimente trasferimento genico in vivo
E assolutamente
Sono numeri assolutamente rilevanti vedete che la proteina espressa da questi virus Bcl due presso il tanto presente nel suo ma amava anche a posizionarsi come correttamente dovrebbe fare nel
Nelle nel mio dendriti ENI e i neuroni nei prassi che partono da e di questi solo il cellulare
Rete anche che se uno va a colorare specificamente con un anticorpo contro Bcl due lasso tempo colora queste cellule con un anticorpo che che mi identifico una proteina neuronale
Rete che nella maggior parte dei casi le stesse cellule che all'interno
Del nucleo esprimono questa proteina specifica per i neuroni sulla le stesse cellule che nel citoplasma esprimono Bcl due quindi il virus Trust luce selettivamente le cellule neuronali
E non s'introduce invece le cellule della glia e cioè è un virus che ha una selettività specifica dei neuroni
Rete anche che se voi decorticato e questi ratti nella corteccia visiva posteriore il in neuroni
Del nucleo genicolato laterale muoiono questo è un effetto di apoptosi specifico dei neuroni dovuto al danno dell'assone usata quantificare i neuroni che Moriero moglie non specificamente in Euronics che non esprimono Bcl due tradotto cioè in altre parole tutti i neuroni che vengono traslochi sono protetti dal
Del della morte per apoptosi causata da de Sonica azione
Vi ho detto che volevo far rivedere problemi più che risultate brillanti bene sue prendete questo virus lo mettete nel cervello funziona benissimo sempre detto questo io sto mettemmo Oslo funziona benissimo se prendete le cellule ematopoietiche staminali un disastro se prendete i fibroblasti un disastro splendenti i cheratinociti un disastro c'è un virus
Che ha un troppi Isma'selettivo per cellule postumi Totti
Quale sia il motivo di quest'evento è assolutamente sconosciuto provvedete dei fibroblasti in cultura con un virus che esprime AV GE Spini
E vedete che lì il efficiente trasduzione bassissima sfrattate queste cellule con diversi agenti che danneggiano il DNA aziende questo caso sono tre concentrazioni Drossi urea raggiunse gli eletti mitomicina C vedete che l'efficienza con cui questo virus si esprime è molto più alta non è un problema di espressione
E e non è un problema di infezione il virus qui dentro in tutte le cellule in diverse migliaia di copie in ciascuna cellula è un problema di conversione del singolo filamento doppio filamento c'è esiste una funzione cellulare
Che presenti costitutivamente neuroni nel muscolo ma che è assente o esiste un inibitore che rimosse invece è presente in quasi tutti gli altri tipi cellulari
Il fatto che si è venuta la voglia che devo un po'accelerare no
Perfetto
Questi sono problemi di biologia molecolare direttori ci sono anche problemi di biologia molecolare di biologia cellulare dei sistemi in cui Beth che i vettori vanno tra sedurre questi li avete sentiti
Elencati da Claudio Bordignon stamattina ad esempio per quanto riguarda le cellule staminali ematopoietiche
Questi se voi prendete un paziente recuperate le celle ci trentaquattro positive da sauna periferico del midollo
Potete tenerli in cultura tra Sturla e con un vettore ridarle paziente in una procedura di trapianto di midollo autologo sulla più di vent'anni che in ematologia si fa i trapianti ma midollo
Autologo con l'unica eccezione di questo passaggio traslazione
Però se fatti in vitro questo passa di trasduzione questo è straordinariamente efficiente ad esempio Confettora retrovirale potere tradurre l'ottanta novanta spesso il cento per cento dei precursori staminali che poi rallentati in vitro
Se prendete questi stessi precursore staminali e questo è quello che è stato fatto in più di cinquanta trials clinici
E ormai troverete che una piccola percentuale di cellule sopravvive anche a distanza di molti anni l'avesse sentito nel caso dell'agenda Minasi descritto questa mattina ma troverete anche se la maggior parte dei casi questa percentuale è veramente piccola cioè e al di sotto della quantità di cellule che possono essere etereo periodicamente utili è un problema
Evidentemente non di trasferimento genico ma è un problema di biologia cellulare c'è ogni volta che queste cellule
Vengono tenute in cultura le cellule staminali ematopoietiche avevano tenuto in cultura coltivate fatte replicare per essere tra astucci bilico questi tipi di vettori queste cellule non soltanto replicano ma anche tendono a differenziarsi dice si indirizzano verso un tipo cellulare che le fa perdere che le fa perdere le loro capacità
Liberamente staminale di ripopolazione del midollo sono di nuovo più di vent'anni che i metodi sperimentali stanno cercando e risolve il problema di coltivare in vitro
Le cellule staminali ematopoietiche evidentemente questa procedura funzionerà straordinariamente bene quando questo problema che non è un problema specifico da terapia genica
Sarà risolto
Finisco gli ultimi due minuti
Cercando di trasmettergli un concetto e cioè abbiam visto un poco di quali sono i problemi molti altri e avete sei di stamattina molti altri li potete leggere sul riviste scientifiche e allora siamo giunti a un punto in cui forse non è il caso di pensare come far la terapia genica di un certo tipo di malattia perché questo ovviamente è un tipo di applicazione
Molto importante però e e tecnologicamente molto complicato è molto complicato pensare di curare un paziente in cui tutte le celle sono geneticamente di fettine molto tesa difficile pensare di curare un paziente da un tumore che ha una grossa massa più molte metastasi
Quindi si è giunti fosse il punto in cui varrebbe la pena di pensare come applicare le cose che noi sappiamo funzionano la terapia genica a problemi di ordine medico che invece siano risolvibili con le tecnologie attualmente disponibili vi faccio vedere come un flash
Due di questi tipi di applicazioni entrambi nell'ambito delle malattie cardiovascolari
E la prima di queste applicazioni e quelle che si propone di indurre neo Angelo Genesi
Nel cuore questa innata negli ultimi due-tre anni soprattutto grazie allo straordinario aumento di conoscenze che c'è stato nel campo Dell'Angelo Gene silente genesi che è regolata da tutta una serie di molecole che agiscono come e ligandi solubili che si legano a tutto una sere di recettori che sono per la prevalenza tiro si inchina sette che traducono un segnale di proliferazione eccellendo teli Ali e di formazione di nuovi vasi
Ora
Esiste una fortunata combinazione oggi in cui ne sappiamo che molte di queste molecole sono attive anche da sole nel attivare un programma di aggiunge nel senso elencate qua e questo e combinato al fatto che e il la cardiologia interventistica ci offre oggi degli strumenti per arrivare con relativa semplicità al cuore in nei pazienti e ce ne possiamo pensare di trasferire questi geni terapeutici per via intra coronaria per via intera
Direttamente nel miocardio ad esempio nel corso di intervento chirurgico o direttamente le mie targhe semplicemente con cateterismo esistono dei sistemi di navigazione
Intera arteriosa che consentono di capire esattamente dove uno e a livello della parete interna del eventi pro sinistro capire quella zona ischemica iniettare selettivamente dei geni in questo tipo di zone
La seconda applicazione sempre in ambito cardiovascolare un'applicazione che riguarda il trenta quaranta per cento a seconda dei distretti delle arterie che vengono sottoposte a un intervento di angioplastica angioplastica è una procedura in cui con un catetere si arriva a livello di un ostruzione arteriosa dovuta presenza una placca tra Roma tosa
E il cardiologo gonfia un palloncino sul cattedre questo catetere rompe la placca del trenta quaranta per cento dei casi succede un evento di questo tipo questo è un maschio modello di ratto in cui è stato fatto un danno all'endotelio
E cioè nello spazio di poche settimane la parete arteriosa reagisce con una proliferazione veramente massiccia
E spaventosa di cellule che provengono dall'atto unico muscolari lisce costituiscono una neo intima che molto spesso più del vaso peggio di quello che faceva la placcate Roma tosa prima
Qui si tratta di far terapia genica di mezzo centimetro di arterie in cui possiamo facilmente arrivare con un catetere riusciamo a trasferire dei geni che bloccano la proliferazione di queste cellule
Ecco che con molta semplicità avrò fatto un intervento di terapia genica selettivo specifico e molto importante
E il paziente
Su questo dato per dirvi questa mia entusiasmo nei confronti di questa applicazione di terapia genica prelati e cardiovascolari e non tutti hanno condiviso da almeno una dozzina di Tajani recitano e delle date son tutti i Trials clinici che sospinge a partiti o comunque già approvati in cui le date sono quelle degli ultimi due massimo tre anni
E quindi io sono convinto che i primi successi veri clinici la terapia genica
Verranno proprio dall'applicazione di questo tipo di tecnologie
Vi ho fatto
Veder pochi dati ma lasciatemi almeno ringraziare le persone nel mio laboratorio che si occupano di questi problemi torna Gentilini Alessandro mantello si occupano del trasferimento genico con i vettori e ad associati e curarsi c'era mio Mendoza si occupano di trasferimento genico
Nel cuore nelle arterie rispettivamente
Riccardo Priore Mario Costa sono coinvolti nel problema dello studio determinanti molecolare del silenziamento dei vettori retrovirale di cui ho parlato vi ringrazio l'astensione
Grazie Mauro per questa interessantissima presentazione
Se c'è qualche domanda veloce e importante ma anche dei più giovani
Voleva sapere per quanto riguarda gli atti non associati sicuramente se non bellissima assisteva però il fatto di doversi sempre fare comunque c'è usare della relativa spettatori può creare dei problemi è stato risolto è superato com'è la situazione
Sì non questa la depositi IVA vecchia non non si usa più l'adenovirus hanno sempre l'adenovirus perché esiste una regione gli adenovirus
E che si chiama i for six che la Regione codificata delle proteine di adenovirus che sono in grado di stimolare funzioni cellulari che son quelle che non sono le funzioni sulla non note che servono per questo io lo spero di fatto la produzione di questi vettori Tesserin fatta Cotral aspettando il genoma da intaccare con un altro per la Smith che contiene soltanto questo piccolo segmento del genoma di noi russe e rette capp
E questo tipo dico trascrizione da dei lettori che sono altrettanto e forse più efficaci di quelli che una volta si ottenevano utilizzando adenovirus
Ecco forse non sono stata abbastanza attenta ma i livelli di integrazione Celli Panda Stifani sezione accadere associato in che percentuale si interno è stata studiata si sa non si sa
Dunque quello che si sa e che in vivo e che si è muscolosa nel cervello lei queste traduzioni dall'associato traduzioni che vivono Vietti e che rimangono virtualmente per tutta la vita
Dell'animale
E c'è ancora discussione sul fatto che questo rappresenti effettivamente degli eventi di singole integrazione delle cellule o sia invece mantenimento il Piso male di costrutti che comunque sono stabili M vengono mantenuti e vengono espressi
Quello che è certo è che questa proprietà di integrazione sito specifica
Mi cromosoma diciannove dipende dalla presenza della proteina rette
Quindi se un costrutto non ha la proteina netto e se la può tenere nomine fornita in altra maniera l'integrazione se c'è e l'interazione casuale del genoma
Ci sono domande
Buongiorno dunque volevo fare una domanda riguardante i dati che lei ha mostrato
Ho visto che nei trial clinici sono stati attivati soprattutto negli Stati Uniti da ridati si vede che l'utilizzo di herpes virus come vettore soltanto l'un per cento rispetto a invece le grandi percentuali di altri virus volevo sapere se secondo lei in un futuro potranno essere utilizzati soprattutto per le terapie di malattie nervose visto utopismo naturale di questo il corso
Se il respiro sono assolutamente promettenti
Se ci sono sostanzialmente due o tre forme di usare gli herpes virus e cioè di usarli come virus effettivi che si che oscura di replicarsi o virus attenuati che si replicano oppure cosa che io preferisco anche per la proponibilità clinica di usare ampi ricconi cioè plasmidi circolari che poi sono intaccati all'interno di costrutti con presso virus questi tipi di studi stanno procedendo ore sono un po'limitati dalla complessità del genoma di herpes però come come giustamente diceva hanno grandi possibilità soprattutto per le cellule
Del tessuto delle cellule nervose non dimenticando che però in realtà Air presi in cultura tre infette quindi vettori tra seducono una serie di tipi cellulari molto estesi comprendono sembra perciò le staminali ematopoietiche
Per cui sono anch'io convinto che il problema della complessità del vettore abbia un po'limitato questi studi ma che possono diventare un un sistema interessante
E se non ci sono altre domande
Come ecco chairman ho rinunciato a fare un vera e propria presentazione però vorrei semplicemente dire due parole su uno degli aspetti di patologia che possono essere affrontati con la terapia genica Nasso laboratorio si è occupato per molti anni di angiogenesi
Praticamente deserto morale ovvero la possibilità di bloccare la crescita di un tumore come dice la stampa soffocando ogni la l'i vasi sanguigni e quindi impedendo l'apporto di di nutrimento e anche la capacità di diffondersi a distanza con le metastasi questo tipo di terapia come è stato riportato spesso di farsa dalla terapia cito tossica del tumore in cui si interviene dall'aria terapia
Con interventi che devono uccidere le cellule tumorali magari vengono fatti a cicli
E per un periodo limitato alla vita ma è quasi una terapia cronica in quanto una volta interrotta e possibile cani o plastica ritorni Paròn andiamo una terapia bassa tossicità e quindi diciamo che se si riuscisse a fare una terapia di tipo genico di introdurre un gene a lungo termine di questi inibitori aggiunge Nesi nell'organismo
Si potrebbe pensare di avere un vantaggio anche per il paziente in un po'l'opposto di quello che ha rappresentato dottor giacca per le malattie cardiovascolari in cui alcuni casi invece si vuole proprio a stimolare la cella indotte agli anni
E quindi prima di passare la la moderazione a Mauro giacca volevo introdurre ninne un intervento di una nostra Giovanni borsista Chiara marchi sogni che parlerà di terapia genica anche Angelo genica Collina citochine
E volevo anche sottolineare che il parente un po'povero di questi vettori a il plasmide
Anche però da eventualmente DNA nudo ci si può aspettare nel futuro qualche cosa di di più e che potrà magari essere accessibile a a una qualsiasi laboratorio
Ecco per ragioni di tempo cercate di stare nei dieci minuti in modo che poi Corleone mezza così riusciamo a fare l'intervallo tra alla come diceva la dottoressa Albini abbiamo sviluppato due approcci dice terapia genica ante anche Angel genica
Utilizzando delle citochine in particolare abbiamo utilizzato l'Inter fronti classe uno espressi in vetta del retro virali
E interleuchina dodici espresse in un vettore nudo appunto
E come modello
E per i nostri studi abbiamo usato il sarcoma di Capozzi crea una patologia che si ripresenta soprattutto nei pazienti di HIV o comunque in pazienti immunodepressi
E che ha come caratteristica una intesa vascolarizzazione e quindi un ottimo modello per studiare l'inibizione dell'Ance Censi
Quello che l'abbiamo abbiamo già studiato e che l'interferone di classe uno cioè l'interferone altre interferone beta sono in grado di ridurre la migrazione delle cellule endoteliali a loro per proliferazione e loro differenziamento
Quindi simile essendo già appunto di uno Stato che l'Inter strani classe uno come molecole ricombinanti sono in grado di inibire Angelo genesi abbiamo voluto studiare un sistema di trasferimento genico in modo da a colpire e direttamente nel sito dove le ha nel sito tumorale dove l'angiogenesi effettivamente avviene i primi strati abbiamo utilizzato quindi un sistema pale di cellule pacca Ginny
Che produce un vettore retrovirale che esprime l'interferone alfa l'interferone beta Morini
Abbiamo poi quindi studiato il questi Vittorio tra virali appunto dei sarcomeri Capozzi
In questo caso potete vedere la lo sulla struttura del vettore i due-tre astieni sono posti sotto il controllo delle TR esiste un gene per la selezione
Della mio vicino a perfezionare i cloni cani incorporato il vettore questo vettore viene tra spettatore nelle cellule parcheggi Inca contenendo cado polentone sono in grado di produrre nel loro super natante delle particelle virali che trasportano appunto il gene per e l'interferone alla cellula patteggia ovviamente produce Ayane essa stessa
Molecole di interferone la prima analisi che abbiamo fatto è stata ovviamente l'analisi in vitro analizzando la capacità di cellule endoteliali pre trattate come surnatante le cellule pacca Gini
Di rispondere a una stimolo e sia che mio tattico che invasivo nel testi che l'invasione di che vietasse si può vedere come le cellule
Non nelle cellule o al type rispondono a uno stimolo che mio tattico
Evita così anche alla stimoli invasivo le cellule tra due-tre trattate con intorno tante le cellule pacca Gin che non esprimono che esprimono virus vuoto
Ah no allo allo stesso modo una una notevole risposta ma questo non avviene sia in che vietasse che in invasione per le cellule trattate per quarantotto ore al Coni
Super natanti che esprimono vi producono avvio se esperimenti interferone in questo caso si Alfa che Beta
Quello che abbiamo poi studiato è la capacità delle cellule endoteliali di produrre una Networks cari capillari like una volta più state firmate traccia una membrana basale ricostituita
Le cellule endoteliali dopo quarantotto ore formano queste strutture appunto dall'indole capillare laiche e sono in grado e questo è quello che fanno le cellule praticamente di controllo
E quello che invece succede se le cellule endoteliali vengono pretrattati e con interferone con super natante di cellule pacchetti in producenti interferone beta è che queste strutture non non sono più in grado di formarsi a sorpresa invece quelle che esprimono interferone alfa presenza solo una particolare riduzione della e della capacità di formare queste strutture c'è sembrato quindi interessante vedere l'effetto di un angelo genesi condotti in vivo oltre che appunto testi in vitro e le spugne di madri cioè il materiale è stato sotto iniettato sode in maniera sottocutanea e con contenente dei fattori altamente Angelici sia intoppi immuno competenti
Che intoppi nudi e il livello di Angers genesi è stata determinati in primo luogo e misurando la quantità di emoglobina contenuta nel Mar Giallo una volta preso il pellet ha ovviamente anche nei topi nudi per evitare che l'effetto che si credeva fosse cioè per capire se l'effetto che si vedeva era mediato dal sistema immune oppure era l'effetto diretto delle dell'interferone
Come si può vedere inizio cioè lui le le spugne di controllo presenta un elevato contenuto di emoglobina così quelle contenenti il le celle cellule pacca Gin che esprimono virosi vuoto
E di nuovo si vede una notevole differenza tra cellulite esperimenti interferone alfa e interferone beta lo stesso risultato si è attenuto nei topi nudi
E quindi come un'ulteriore esclusione che non ci fosse un apporto del sistema immunitario
E l'analisi dei istologica dei Pelletta confermato questo dato e infatti come si può vedere nei controlli si formano larghi e sulle strutture vascolari che spariscono nei pellet e trattati con interferone beta e rimangono
E vagamente presenti in quelle con interferone alfa
Lo è un'altra cosa che c'è sembrato notevolmente interessante era vedere come questi però io ero ben retrovirus erano in grado di inibire la crescita tumorale e quindi abbiamo utilizzato appunto e Cellule di sarcoma di Capozzi
Per analizzare la crescita del tumore a cui in Italia con una volta iniettate in maniera sempre sottocutanea intoppi muove o come in uno compromessi intoppi nudi di nuovo
E come si può vedere all'asta le cellule di sarcoma di Capo d statico iniettate in un rapporto di dieci a uno con le cellule pacca Gini
E come si può vedere mentre le cellule qual type formano la stanza rapidamente un tumore e così anche anzi forse più rapidamente ancora le cellule contenenti un è un degli uni e la porta a dieci del salone di controllo
Serata una notevole differenza quando sia è stata iniettata cellule che producono sia interferone interferone alfa interferone beta
Lo stesso esperimento è stato fatto ai Coccia contemporaneità Sestero esperimento è stata anche inoculato delle cellule pre infettate in vitro e selezionate
Per la produzione interferone alfa come si può vedere la crescita tumorale risulta nulla è pari a quelli agli ai tumori che sono stati iniettati mixando con le cellule pacchettini
Quando l'analisi istologica di questi tumori ha dimostrato di nuovo la presenza di grossi vasi nei controlli ma non nelle cellule trattate dove si vedono in maniera abbastanza evidente aree di necrosi e cellule ha poc'Toti che come prima conclusione di questo lavoro potremmo dire innanzitutto che nonostante l'interferone i si abile non comune recettore quindi comunque
Apporti si presuppone abbiano funzioni comuni in realtà l'interferone beta risulta molto più anti Angers genico rispetto all'interferone alfa che invece no ha sicuramente una funzione importante sulla crescita tumorale
E inoltre che un approccio di terapia genica può essere veramente una buona soluzione appare e un approccio pre clinico la pure parla la terapia del sarcoma di Capotosti la seconda parte del nostro lavoro invece riguarda l'interleuchina dodici interno china dodici sicuramente a una importante citochina prodotta
Dai per le il predetto lotta durante la risposta dei che accade timore esposti muretti e Chuan
E si scusa diverse evidente hanno dimostrato che ha comunque attività intento geniche
Quello che non abbiamo iniziato a studiare la capacità dall'interno china dodici mai del CDA ignari interno che a dodici messi in un vettore
E di inibire lance genesi nel nostro test in vivo con le spugne di matrice questa è lei in sintesi il vettore che è stato utilizzato c'è un promotore forte Caccia M. V. e e poi sono state prodotte le due subunità all'interno china dodici ceppi quaranta e P. trentacinque
Che vengono praticamente spesso sono in un vettore bici stroncò con Lares
Questo vettore è quindi stato inoculato e nei topi nudi amenità P uno quei niente i topi
Critici cinquantasette black praticamente prima due giorni prima dagli no quello del matrice Lepa allo stesso momento
Della di in cui vi è stato inaugurato il Madrid delle testate è stato analizzato la formazione il analisi dei pellet dimostra evidentemente che e i Peppe letti controllo sono molto Angelici mentre quelli con interlocking dei topi trattati tenta lo china dodici gli antigeni si è notevolmente diminuita lo stesso dato viene dimostrato anche con la con l'analisi delle del contenuto di emoglobina dove si vede la differenza piuttosto notevole
E così anche dall'analisi istologica dei pellet dove i controlli si vedeva che vi è un grosse strutture vascolari che risultano comunque assenti nei topi treno curati con interno china dodici
In conclusione di questi primi dati che abbiamo avuto possiamo quindi dire che la inizia l'inoculo e intramuscolare di un plasmide che sperimenta lo china dodici è in grado di inibire lancia Genesi
I dati non glielo dimostro non gli ho Motor stati tutti comunque e anche in età più inutili quindi che mancano di risposte che H uno e così nei cinquantasette black che sono stati definiti delle cellule anche e si può vedere una unioni inibizione dell'antigene sì quindi dando dei dati preliminari che suggeriscono che nelle anche D'Astore nelle celle lettiga sole sono in grado dice sono critica parli inibizione in effetti inibitori Angelici dovuta all'intero china dodici
Voglio concludere rapidamente ricordando che tutti i lavori sentano china dodici esecutore lavori di invio stati condotti da Monica Morini
E l'impiego dell'interferone da Luciana Masiello nei nei settori retrovirale sono stati forniti dal laboratorio io dapprima da poter professor Berardelli e da Maria Franchini delle SS di Roma il rettore l'Inter lo china dodici Diane Schultze
Tutto è stato condotto nel laboratorio di alla dottoressa Albini e del dottor Noonan
Se abbiamo tempo per una domanda
Te ne faccio di una
Nikos sperimenti in cui mescolate
Prima parte capo si in cui mescolate ce l'ho e tradotte con cellule non Trust dotte avete scelto una rapporto di dieci a uno non sostò tradotte
Sino ritrovato rapporti diversi fiera non c'è rimarca di criticare altana e abbiamo sì io lo abbiamo fatto un calcolo sul dosaggio
Cioè ne abbiamo calcolato i dosaggi di sì di interferone che venivano prodotti dalle cellule pacca jeans e siamo stati più o meno sulle due mila cinquecento unità
O giù di lì pare Agli più o meno abbiamo calcolato a al per le cellule pacchetti in modo da vera un'idea tessuto saggi due mila cinquecento quintali al giorno civili per potere confrontare con i anche con dei dosaggi di tipo e di Portinari con Vinante perché ovviamente cioè bisogna comunque cercare di mantenere un rapporto abbastanza si
C'è la domanda quindi sale
Magari
Anche l'approccio che combini interleuchina dodici alla diciotto che è riportato recentemente essere diciamo così e ottenere un effetto sinergico su questo tipo di angiogenesi inoltre volevo chiedere se era stato erano state portate avanti studi che considerino la capacità della dodici di stimolare l'interferone gamma con questo una risposta ti H uno molto forte mi domandavo se l'inibizione
Della crescita in Sogemi chiaro comunque inibizioni tumorale
Che passa sabotata dalla dodici possa essere provocata sia da un approccio che siamo così anti Angelo genetico sì anche
Da un stimolo stemmi stare fuori per ovviamente io non l'ho presentato un po'per motivi di tempo parto dall'ultima domanda
Per motivi di tempo e comunque sono ancora dati preliminari nei topi nudi ovviamente non c'è una risposta ti H uno quindi si può escludere questo fatto
è stato fatto un primo esperimento nei topi nudi anche con la defezione di anche quindi anche se poi queste per cioè ovviamente dobbiamo ancora verificare tutti i dati e quindi rimane comunque per eliminare ogni inibizione dell'ANCI Chienti si vede
Sicuramente la la produzione interferone gamma cioè l'Inter Lucchina dodici sì però non ci stiamo chiedendo se effettivamente inibizione della Genesi non arrivi anche da altre di oltre che da una risposta immune che sicuramente è importante per quanto riguarda la prima domanda no non c'abbiamo ancora
Pensa
Aggiungo due cose questa domanda di questa o molto grati uno andarla in combinazione fra diciotto non ancora sta fatta ma sentirete la prossima presentazione la comminazione con la quindici quindi e secondariamente questi sono dati che sono appena stati elaborati laboratorio e non c'è nessun induzione di interferone gamma abbiamo analizzato i sieri di tutti i topi con l'aiuto del veterinario Emmental troviamo induzione di interleuchina dodici ovviamente invece gli ammassi
Bene grazie passiamo alla prossima presentazione che di Alberto commesse che ci parlerà sul trasferimento in un tumore in un modello di tumore Mecacci negativo
Di interloquire dodici ente Lucchina quindici e gli autori oltre a chi presenta sono di Carlo musivi Meazza Albini F. Fubini
Cercherò di essere breve perché abbiamo tutti i fan
Allora da redatte espressione del sistema maggiore dista compatibilità di classe uno rappresenta un un meccanismo di timore Scekic di per poter scappare dal controllo del risposta immune mediata dalle cellule tutti
E che quindi previene l'immunoterapia basata sulle cellule T
Le cellule anche ai hanno la caratteristica di riconoscere di rizzare le cellule M. HC negativi e questo rappresenta un meccanismo alternativo
Di immunoterapia per questi tipi di tumori cioè Mecacci negativi
Il carcinoma del polmone piccole cellule è un tumore molto aggressivo che ha la caratteristica di mancare l'espressione del Mecacci di classe uno
E questo dovuto o alla da regolazione di un molecola di trasporto TAP
O all'espressione dei geni della classe uno
Noi in questo lavoro abbiamo utilizzato la linea di cellulare del carcinoma del polmone a piccole cellule N cinque nove due
Trapiantata nel modello del topo nudo
Per lo studio del gli approcci di immunoterapia basati appunto sull'immunità naturale
In particolare noi abbiamo analizzato il possibile effetto cooperativo
Di citochine stimolanti le cellule ANCAI come io le quindici e diede dodici mediante trasferimento igienico
Questo ci è venuto dalle anche perché avevan visto in abbia letto in letteratura che in vitro ai c'erano già stati di lavori sul la effetto cooperative tra il Duecento china
Allora interloquirà quindici
Non in uno stimato una citochine muro stimato aria che media attività
In particolare gliele quindici produce attiva Cellule attiva cellule T cellule di c'erano in Kaye è un potente induttore della risposta l'acre
Induce lati attività di macrofagi e di di cannoncini think
Allora per effettuare trasferimenti genico di alle quindici noi abbiamo utilizzato in vettore di espressione Plast mimico contenente cd ne ha modificato di alle quindici
Qualificante per una pre Protti e pre proteina
Portante la catena leggera delle immunoglobuline
Questa strategia permette appunto rimuove la Regione devo davo regolante c'era la la traduzione
Fornisce una più efficiente sintesi e secrezione di Tacito china per quanto riguarda l'altra cito Kia utilizzata il dodici alla caratteristiche sarà citochine applica topica e secreta da vari tipi cellulari come monociti macrofagi
Dette cellule dendritiche ed è capace di attivare sia le Cerretti che le cellule anche ai delle dodici è anche un potente dottore della risposta ti H uno alla caratteristica di di promuovere edilizia ed eccelle anche ai della allora attività cito tossica e la produzione interferone dramma inoltre ha caratteristica di essere un fattore anche ingerito mediante indizione di citochine secondarie commenta Franca Marzi IP dieci
Per quanto riguarda il trasferimento genico e abbiamo utilizzato dello stesso pittore ddl quindici naturalmente utilizzando una una diversa resistenza
Radio fetta cooperativo
Di clinici di diede dodici
Trasferimento genico dire quindici milioni c'è è stato valutato mediante impianto sottocute nel topo nudo
Che ha la caratteristica di possedere solamente l'immunità naturale funzionale allora questo che l'esperimento come si può vedere le cellule morte l'aspetto dei sarebbero quelle in oculate con Trust
Con il settore vuoto senza le citochine
Presenta una cinetica di crescita molto rapida e niente la crescita del tumore in tutti gli animali mentre per quanto riguarda il tumore tra aspettato con Igli alle dodici
Presenta un debole ritardo nella cinetica di crescita
Per quanto riguarda il il vettore le cellule prospettate con il vettore contenenti delle quindici
Se ha chiaro ritardo nella cineteca di crescita del tumore e un ridotta Morigi vincita nel alcuni animali molto interessante è stato il fatto di vedere che nel in i topi inno cullati con cielo nei cinque nove due tutto al contenenti entrambe le citochine
Tengono competente rigettati in tutti gli animali
Allora da qui abbiamo deciso anche di vedere gli eventuale effetto inibitorio del doppio tra spettante contenenti le quindici e le dodici sulla crescita di un tumore parentale
Allora il l'acqua cognizione sotto cute del doppio tra spettanti con una dose tumori genica di cellule parentali
Induce un una una piccola una parziale crescita tumorale seguite da un completo rigetto in tutti gli animali
Mentre per quanto riguarda lindi l'iniezione sottocute riceve parentali contro tranne in te Aldo tetra spettante
Determina un debole ritardo nella cinetica di crescita
Quel così si può spesso citato perché pensare che presente un potente effetto by stand-up locale mentre è molto debole è un affetto beh stendersi Stenico queste probabilmente può essere dovuto alle basso livello di interloquire a quindici circolante
Allora abbiam pensato di studiare le cellule con coinvolte nel rigetto del tumore come se era l'esempio lenti ai oppure i grandi noci i granulociti per far questo abbiamo decretato i topi con ante segnalo per la defezione con delle cellule anche ai oppure con per la defezione con per antica unicità per decretare richiama di Roma usciti allora è evidente che le l'effetto antitumorale
Del che se serva nel provato riguarda il Trasped tante singolo con gli eserciti e quindici e completamente abrogato in topini che sono stati dettati di cellule anche ai mentre in quelle questo qui è un topo trattato con anticorpo rilevante mentre per quanto riguarda il le Sidoti tra spettanti il la deplezione delle cellule anche ai non alcun effetto sul rigetto
Inoltre appunto abbiam visto la con la cinetica di crescita del doppi tra spettante intoppi decretati di granulociti
E aveva visto che c'era solo un debole ritardo del rigetto questi dati e hanno scritto il fatto che la più che doppi tra spettanti
Agiscono direttamente su altri tipi cellulari
Per investigare appunto il l'effetto cooperativo
I meccanismi che stanno sotto l'effetto partivo dire citochine tradotte abbiamo ha effettuato un'analisi sto lo agita d'immuni sto chimica
Delle are tumorali a venerare tumorale delle cellule parentali ci sono presenti soli poco poche cellule infiammatorie infiltrando il tumore come ad esempio macrofagi
Mentre per quanto riguarda Rita spettanti singoli con transitati Conigliere quindici del dodici sono presenti molti citochine molte cellule reattive e filtranti il tumori il tumore in particolare per quanto riguarda il tumore tra aspettato Conigliere quindici presentai una una maggiore percentuale di cielo lenti a lei inoltre la alla leader l'espressione di Ciancia Assassin'Mct uno
Specie per quanto riguarda il tu morto aspettato con India del dodici presenza all'espressione di tiene Seal fa Inter fra un gamma Gian cessasse e mi due per quanto riguarda il tumore doppio tra spettante presenta un più alto livello di cellule Intini finché infiammatorie filtranti il tumore
E una maggiore espressione di interesse un gamma
Kim che mo'chine come mi due match più una infine interessante mente Sasso abbiamo trovato che è stato invierà una maggiore espressione di ai nostri sarebbe la sentita se indicibile di assicura ossido nitrico
Questo appunto e quindi sopra tra pensare che disse l'attività
Tanti Angelica di cui di queste di quest'anno dell'ossido nitrico potesse essere importante per quanto riguarda il rigetto
Ah quindi per aver multe per informazioni sulle cellule coinvolte nella produzione di ossido nitrico mai abbiamo isolato
Ma profarmaco Profaci e granulociti e siamo andati testare la loro capacità di produrre ossido nitrico in ecco cultura con macro con il dotata sprezzante
Come potete vedere il i macrofagi sono in grado di produrre ossido nitrico
Quando sono Messico cultura con capita spettanti mentre per quanto riguarda i granulociti queste non avviene
Inoltre abbiamo testato le varie linee per quanto nella produzione di ossido nitrico da parte dei macrofagi
Si può vedere solo in forte produzione solo nel doppio tra spettante
Conte brevemente siamo andati anche a valutare l'attività cito tossica dei di di quel dei macrofagi sulle cellule tumorali ed ho visto che inizierà la presenza di fenomeno di inibizione della crescita tumorale per quanto riguarda singolo tra spettante ma la maggiore inibizione tumorale si aveva solo nel doppio tra spettante
Quest'ultimo dato ci ha portato a pensare fenomeno cioè che
Sì aveva la edilizia dalla crescita tumorale del doppio tra spettante anche in assenza della produzione di ossido nitrico
Quindi siamo andati a abbiamo pensato che ci potesse essere un milizie nate la crescita tumorale
Sia dovuto meccanismo dipendente dalla produzione di acido nitrico che indipendente dalla protezione di ossido nitrico
Per far questo per verificare questo fenomeno a sé mandati a fare con cultura con cervico macrofagi e dove tra settanta e in presenza di un inibitore specifico di ai nostri cioè è minima
Interessante nei testi e trovato che in presenza di questo editore si ha una forte inibizione dalla produzione di ossido nitrico mentre non altrettanto sia unanimi inibizione della cito tossicità
In conclusione si può dire che l'attivazione dei macrofagi
Mediante azione sinergica di gliele quindici chiede dodici può portare a un effettivo inibizione da precetto morale indipendente da cellule T eccellente ai inoltre questi dati forniscono un nuova luce sulla possibile effetto per l'attività cooperativa diede quindici retorici nella stimolazione di una risposta immunitaria naturale
E questo effetto cooperativo potrebbe essere rilevante per lo sviluppo di strategie di terapia genica immunitarie con citochine nelle il rigetto contro i tumori che mancano di sistema maggior liste compatibilità di classe uno
Fine volevo ringraziare chi ha lavorato a questo progetto
Nel laboratorio del dottor Ferrini Raffale Meazza desse leggero Ombretta rosso batte Stefania balsamica processando Ambrosius e per quanto riguarda la parte istologiche munito chimica è stata fatta Università di Chieti era tre Salvini per il vettore contenente delle dodici grazie scusa
Abbiamo tempo però una domanda
Qual è il legame molecolare fra il le due le quindici e in osso
Fra
Fra le spese e le due le quindici e l'attivazione della sintassi dell'ossido nitrico
Cioè due punti visto molecolare come si spiega questo effetto sinergico non non si sa veramente
Tra vanno cioè
Se immediato però
Mediato dai
Grazie grazie
Allora l'ultimo al relatore Stefano Indraccolo
Che ci parlerà assumere Fejzo versiliesi colloco scontro Riggio si con Season è gestire Splash al nord varie trovare Vector s'gli altri attori sono minuziosa Morichini tabelle roccaforte amatorie che Cobianchi onestà di Padova
Bene
Buongiorno a tutti diciamo con questo mio discorso conclusivo ritroveremo un momentino indietro sulle tematiche sollevate prima datato fisso giacca il nostro dopo si è occupato da alcuni anni della regolazione dell'espressione genica da parte dei vettori retrovirale i basati sul virus di Moroni
E un po'tutto il nostro lavoro è stato fino al finalizzato alla ottimizzazione d'espressione indigeni Reporters da parte di questo sistema virale che fino adesso
Rappresentato il sistema viale anche più utilizzato nei trans clinici
Mi allaccio direttamente a quello che diceva prima Mauro giacca uno dei limiti importanti dei titoli rétro virali
Lo spegnimento dell'espressione del Gene alle porte rotte Gene Therapy ottico che si osserva sia in vitro se coltivatrice detto spot abbastanza lungo ma soprattutto in maniera più preoccupante in tv
Il progetto di cui riferisco oggi rappresenta un tentativo di rimediare a questo spegnimento prescrizionale e in particolare noi ci siamo chiesti la abbiamo investigato la possibilità di utilizzare una sequenza denominata all'Opus control prigione derivata tira un gene umano il CD due
Al fine di ottenere espressione livelli alti di tessuto specifica di un genere riporterò terapeutico specificamente nel tessuto linfoide ti l'obiettivo che ci ponevamo possibilmente di rimediare in qualche modo alla grande variazione l'espressione genica che normalmente sia a seconda del s'
Sito di integrazione del profilo signora c'ero persa prossima depositi
Per quelli che per i quali le siamo non siano familiari diciamo che queste sono sequenze che sono molto importanti per dirigere l'espressione a lungo termine dei geni cellulari
La loro attività è stata soprattutto caratterizzata nell'ambito dei topi transgenici e a questo momento
Sono disponibili disperse sequenze sia che quindi potrebbero essere utili nell'ambito di rito retrovirale
Il nostro lavoro si è quindi focalizzato sulla sia alta il gene CB due che ha un gene Espresso negli info CCT perché i linfociti T perché ovviamente come ricordava anche po'Tinian prima infarciti ti rappresenta un target molto importante per la terapia genica
E un altro motivo era che le dimensioni di queste sia sono abbastanza piccole due chiedo Pasi da essere poter essere clonata in un vettore profilate
Il terzo motivo è che l'attività di questa specifica il segnale era stata ampiamente studiate da una decina d'anni in particolare da molti lavori nel in Inghilterra dal gruppo di Dimitri stiamo su su quindi c'era moltissima informazione
Quindi abbiamo generato una serie di costrutti retrovirale che come sempre in questi casi diciamo hanno le due iniziale e contengono in varie posizioni la sequenza e se altri due punto uno chiedo basi oppure in diciamo in alcuni casi abbiamo anche ritenuto opportuno di valutare gli effetti di una forma troncata di queste sia in tutti i nostri studi in usiamo un genere ipoteche è molto interessante perché è molto facile
Investigare la sua espressione è che là dentro esce un potente inoltre devo dire che noi generiamo questi vettori facendo una trascrizione multipla di una linea che chiameremo pecche cinque due nove preti
Conto uno di questi costrutti che contengono il genere porterà idem le sequenze che ne dovrebbero modificare la funzione assieme a un costrutto che fornisce
Le parti considerati e a uno che fornisce un ente lo poi raccogliamo il sopra natante Gilli queste trascrizioni e lo usiamo per per lo stupore delle linee versati
Risultati di una tipica trasduzione con alcuni di questi costrutti sono stati qui dove fosse stato opportuno solo per questa spegnere un po'la luce
I gestire è un marker
Appunto fluorescente dà origine all'altro scienza avverte quando voi tasto ceto Marina linfoide tic con questo Mark Nina molti altri e utilizzando un vettore retrovirale standard in cui decide di mosso dalla dall'attività delle letti a ritirare voi ottenete alcune cellule molto verbi che esprimo cioè il market a livelli molto elevati
E cellule molto pallide chiedo esprimono a livelli molto bassi o sono addirittura Bucci questo punto rispecchia secondo noi la diversa le integrazioni siti diversi del genoma detto virus e a seconda che l'espressione sia favorevole o no ottenete o meno ce lo dica
Abbiamo poi diciamo indebolito artificialmente l'attività di questo costrutto eliminando le danze virale e poi diamo inserito su questo tipo di test ponte lei si altri due tipi come potete vedere
No io teniamo in questo tipo di studi una espressione di certi che è a livelli intermedi quella diciamo generata da un costrutto basale il quella ricostruttori partenza ma il dato più interessante è che molto più omogeneo il verde tra le diverse cellule cioè l'espressione di gesti sembra essere meno dipendente
Dal sito di integrazione nel genoma di quanto lo fosse nei nostri partenza
Una sequenza di controllo delle stesse dimensioni ma priva di attività iniziale invece non riesce a ottenere questo tipo di effetti sulla espressioni gesti
Questo stesso tipo di risultato
Può essere anche analizzato in maniera quantitativa ricorrendo all'analisi cito frodi metrica e diciamo si ottengono diciamo dei tracciati in cui dentisti d'intensità di fluorescenza rappresentata sulle ascisse e quindi diciamo tanto tipico spostato verso destra tanto più le cellule sono verdi e il numero di cellule che don Gino è invece inopinate voi potete vedere come quando voi tra succede una popolazione linfoide confetto che stando a quello che mette una espressione gesti molto
Prodotto molto ampia
Che riflette quello che avete visto nella diapositiva prima invece quando voi tra società e la stessa linea con un vettore portante questa iniziale il il picco di espressione molto più ristretto è un'espressione di tipo uni modale
Invece questo non si ottiene con ad esempio la sequenza di controllo che ha un inchiesta il coscienza molto molto bassa e praticamente simile al modo
Il pannello di sinistra vi dice solo che questo tipo di Effetto della iniziale espressi specifico piaccia all'infuori di e infatti non si osserva in cielo lessico plastiche quali sono le cellule i miei stretti tra le mostrate in questo pannello
Infine
Questo stesso tipo di evidenza si può anche ottenesse un'OPA analizzare le espressioni e gesti in singoli cloni derivati dalle culture precedenti
Si vede abbastanza intuitivamente che i cloni che si ottengono dal popolazione cellulare tradotta col virus contenente letizia hanno un'espressione di gesti molto più simile tra di loro di quanto sia per cloni che sono stati ottenuti da un dalla traduzione con un vettore standard
Questo vi fa solamente presente un aspetto sperimentare abbastanza importante cioè che questi effetti delle sia sull'espressione genica
Si osservano solo se uno ha l'accortezza
Di eliminare dal vettore allenarsi alla finale cioè se voi semplicemente aggiungete le sia
Al teatro e standard
Senza dei privarlo delle danze virale che nella sua il tira voi sembra che diciamo gli effetti delle siamo siano mascherati dalla forte attività trascrizionale delle gli Atr e questo è un fatto che bisogna considerare credo nella valutazione delle fette di sequenze
Curatrici cellulari nell'ambito dei vettori virali
Questo gli fa solo vedere che diciamo il frammenti di due punto uno chilo basi cui studi precedenti hanno attribuito l'attività di ARSIAL è veramente fondamentale
Per ottenerla infatti se voi prendete un pezzo troncato di questa iniziale lo clonate nello stesso tipo di settore retrovirale
Voi non ottenete un piccolo distretto dell'espressione di IgE Spini
Rispetto alla settore lì essendo il settore di partenza anche se abbastanza interessante notare che si osserva un enhancement dell'espressione dei gesti rispetto al vettore che non contiene queste danze infante quindi noi pensiamo che vettori virali che contengono Froome troncate della iniziale siano inutili per studiare un'attività diciamo di tipo e siamo a possono essere utili per studiare un un per avere un vettore in fori detti specifico anche perché questo effetto non si osserva in altri tipi cellulari infine
Volevo solo segnalarvi ovviamente la presenza di un troppe in questo tipo di studi c'è sempre un prezzo da pagare in genere
Negli studi in cui si studiano le sia il problema principale la riduzione del titolo finale e questo si osserva anche con questa renziani in particolare editi circa cento volte rispetto ai settori
Di partenza
Infine l'ultimissimo dato intatto in vivo cioè ci si può chiedere questi vettori che portano una s al sono utili anche per migliorare l'espressione genica in vivo
E per rispondere a questa domanda abbiamo fatto uno studio preliminare ma semplicissimo abbiamo preso una linea che era stata generata invito con il vettore standard
Senza il segnale quello con ENEL sia come si può vedere invitato questa linea esprime cespi a di pelli piuttosto elevati fluorescenza tuttavia dopo essere stata impiantata sotto il sottocute di topi skinhead
Per un tre settimane l'espressione del CESPI si riduce grandemente sia in termini percentuali ce le positive chi di fare scienza media e questo non avviene invece quando il dottore portava la sequenza sia questo è un primo indizio quindi che questo possa avvenire anche in vivo
Io salterebbe conclusioni perché devo largamente anticipate e nomine RAI solamente le persone che hanno partecipato a questo studio oltre a me sono che è stato condotto nella Dipartimento di Oncologia dell'Università di Padova
E sono alterabile da Sonia mi Nuzzo Francesco roccaforte ripresa Marchini infine i Jupiter assaltato armato voi il Luigi che copre anche il capo del dipartimento grazie
Grazie Stefano anche per il la puntualità abbia apprezzato dei contenuti
Dottor Ferrini
Noi veramente non l'abbiamo mai provato su direttamente succedere anche lei uno dei problemi che sia lavorare con questo vettore quello con anziani e che siccome il titolo e basso cioè se il titolo stando ai dieci
Cinque per dieci a cinque per la mente queste cinque perché c'era tre
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Arrivederci alla prossima
L'enzima
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